RT-PCR操作流程及其相关注意事项.docxVIP

PAGE PAGE # 、知识背景: 1 基因表达： DNA RNA ? Protein 2、 PCR 技术（Polymerase chain reaction）:即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA聚合酶的酶促反应，其特异 性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A、 变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA ； B、 退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C、 延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2+存在下，退火引物沿 5 ‘ 方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 3、 逆转录酶和 RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于 RNA病毒体内的依赖 RNA的DNA聚合酶， 至少具有以下三种活性： 1依赖RNA的DNA聚合酶活性：以 RNA为模板合成cDNA第一条链； 2、 Rnase水解活性：水解 RNA:DNA 杂合体中的 RNA ; 3、 依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条 DNA链为模板合成互补的双链 cDNA. 4、 引物的设计及其原则： 引物的特异性决定 PCR反应特异性。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物 ，或者在目的蛋 白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 a、引物长度：一般为15?30bp，引物太短会影响 PCR的特