基于13c稳定性同位素微观代谢和宏观代谢信息综合分析的发酵过程优化研究.ppt

基于 13 C 稳定性同位素 微观代谢和宏观代谢信 息综合分析的发酵过程优化研究 A Powerful Tool in Metabolic Engineering 微观代谢流研究的重要性 Genome Transcri ptome Proteome Fluxome Cell E n v i r o m e Osmolarity pH Toxin/Danger Pressure CO 2 Oxygen Sheer Stress ORP Temperature Nutrition metabolism Amino acids Vitamin Enzymes Bio-fuels Antibiotics Peptides Organic acids 其理论基础是中间代谢物的 拟稳态假设 和物料的 质量守恒定律 。 它是在构建好的细胞代谢网络的基础上，先假设代谢网络的中间代谢物 都处于拟稳态，然后根据物料质量守恒定律写出符合该代谢网络的化学 计量矩阵方程，再通过测量胞外底物消耗速率和代谢物分泌速率，最后 计算得出整个代谢网络的流量分布。 A B C A B C N N 基于化学计量学的代谢通量分析（ MFA ） 局限性 ? 能量平衡分析上，全面确定与能量相关的反应非常困难 ? 原核生物中存在大量无效循环 ? 细胞中大量存在的可逆反应、双向反应、回补反应 及并行反应中的净通量 13 C 代谢通量分析 典型的应用是在 连续培养 过程中使代谢达到拟稳态，利用菌体 蛋白原氨基酸的标记信息，对中心代谢途径通量进行计算。 对数生长期和连续培养的拟稳态过程 13 C 同位素标记代谢原理 衍生物 ALA M-15 M-85 F-302 细胞代谢物标记信息的测定方法 建立氨基酸与相应的中心代谢途径中 间物之间的碳原子映射矩阵对应关系 由测得的氨基酸的标记丰度分布信息 推算出对应的中间代谢物的碳原子标 记信息 Ratio Experiment PEP from PPP pathway U OAA from PEP U OAA from glyoxylate U Pyruvate from malate U PEP from OAA U Serine from glycine U Glycine from serine U Erythrose-4-P from pentose-5-P U Pentose-5-P from glucose-6-P U Pentose-5-P from erythrose-4-P U Serine through glycolysis 1 Pyruvate through ED pathway 1 由计算得到的对应中间代谢物 的碳原子标记信息，进而计算 出代谢流经各个途径的反应速 率通量。 细胞代谢途径通量计算 13 C 标记代谢技术的应用 1 发酵生产中 底物（糖、前体等）消耗 较大造成发酵原材料成本较高， 如青霉素、头孢、环孢菌素、维生素、 7-ADCA 发酵等。 2 发酵 生产过程中副产物的组分 含量较高，如谷氨酸发酵过程中乳酸的 积累、维生素 B 12 发酵过程中丙酸积累。 3 发酵产物合成途径的分析， 初级代谢与次级代谢启动 之 间的关系，干 扰素的合成，免疫抑制剂。 4 生产菌株工程菌 改造的基础分析，表型与基因型之间的关系的阐明， 更好地指导工程菌构建。 7-ADCA 发酵过程中己二酸前体的利用 PGA PEP Phe Val Ac-CoA Pyruvate [1- 13 C]Alanine Ru1,5-P 2 Triose-P 1 1 1 1 1 1 PDH PK PGM, ENO R u b i s C O Val 1 Val (1-5) Val (2-5) Phe 1 PHE (1-2) PHE (2-9) PHE (1-9) B D CO 2 PGA PEP Phe Val Ac-CoA Pyruvate Alanine External 13 CO 2 Ru1,5-P 2 Triose-P 1 1 1 1 1 1 PDH PK PGM, ENO R u b i s C O A CO 2 PGA PEP Phe Val Ac-CoA Pyruvate [U- 13 C 3 ]Alanine Ru1,5-P 2 Triose-P 1 1 1 1 1 1 PDH PK PGM, ENO R u b i s C O OAA C CO 2 Fate of labeled CO 2 in fatty acid biosynthesis Scenarios and calculations external feed feed by 13 C1-ala feed b