李斯特菌的分离与鉴定、PCR方法鉴定李斯特菌、间接ELISA方法检测抗LLO的血清抗体.docxVIP

附 录 A （规范性） 李斯特菌的分离与鉴定 取10 g固体样品或10 mL液体样品（包括血液样品）放入90 mL LEB增菌液中（纱布、棉签直接放入），30℃培养16 h。然后用接种环取培养液在科玛嘉显色平板上划线，37℃培养24 h。选取带白色晕环的蓝绿色菌落在脑心浸液培养基（BHI）平板上纯化培养，单菌落用于后期的进一步鉴定。 图A.1 脑心浸液培养基（BHI）上的单核细胞增生李斯特菌菌落 图A.2 科玛嘉平板上的单核细胞增生李斯特菌菌落  图A.3 MOX平板上的单核细胞增生李斯特菌菌落 图A.4 血平板上的李斯特菌与马红球菌的协同溶血试验 （图A1、A.3和A.4为伊氏李斯特菌；图A.2为单核细胞增生李斯特菌）  附 录 B （规范性） PCR方法鉴定李斯特菌 B.1 PCR引物 B.1.1 李斯特菌属鉴定引物： PseF：5’-GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG-3’ PseR：5’-CAAAGAAACCTTGGATTTGCGG-3’ 扩增产物长度为370 bp B.1.2单核细胞增生李斯特菌鉴定引物： LisB：5’-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3’ MonoA：5’-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3’ 扩增产物长度为660 bp B.1.3伊氏李斯特菌鉴定引物?: LisB：5’-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3’ Iva1：5’-CTACTCAAGCGCAAGCGGCAC-3’ 扩增产物长度为1100 bp B.2 PCR扩增 B.2.1 以细菌的基因组为模板，利用引物PseF和PseR首先对分离菌株进行李斯特菌属的鉴定。PCR反应体系（50 μL）：超纯水34.6 μL，10×Buffer（含Mg2+）5 μL，dNTP 4 μL，rTaq酶0.4 μL，上下游引物各2 μL，模板2 μL；PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。 B.2.2 反应结束后，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，分离株鉴定为李斯特菌属后，继续用2种引物（MonoA和LisB）和（Ival和LisB）分别进行种鉴定，PCR反应体系如下： 超纯水 27.75 μL 10×PCR 缓冲液 5 μL dNTP (2.5 mM) 5 μL MonoA、Iva1 各2 μL LisB 4 μL rTaq DNA聚合酶 0.25 μL DNA 模板 4 μL 总的反应体系 50 μL B.2.3 在对李斯特菌进行PCR的过程中，若以菌落为模板做PCR，则DNA模板体积为0，以超纯水补齐不足部分的反应体系。细菌的加入方法为：用灭菌牙签挑取菌落，转移至加有50μL反应混合液的PCR管中与管壁轻轻摩擦和搅动。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。 B.2.4 反应结束后，产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。反应的体系与条件参照李斯特菌属鉴定，其中退火反应设为58 ℃，1 min。用属鉴定引物PCR扩增出370 bp的条带判定为李斯特菌属；用单核细胞增生李斯特菌鉴定引物PCR扩增出660 bp的带判定为单核细胞增生李斯特菌；用伊氏李斯特菌鉴定引物PCR扩增出1100 bp的条带判定为伊氏李斯特菌。 B.3 结果判定 若扩增出370 bp左右的条带，则对应菌株鉴定为李斯特菌属的细菌，如图B.1泳道1和2所示。在扩增出李斯特菌属特异性条带的前提下，若扩增出660 bp的条带，如图B.2第1泳道所示，则为单核细胞增生李斯特菌；若扩增出1100 bp的条带，如图B.2第2泳道所示，则为伊氏李斯特菌。 图B.1 李斯特菌属鉴定PCR扩增结果 图B.2 单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌种PCR扩增结果 附 录 C （规范性） 间接ELISA方法检测抗LLO的血清抗体 C.1 用0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将LLO蛋白稀释，包被于96孔板中，包被量为0.5 μg/孔，于4℃过夜吸附。 C.2 次日用PBST洗涤3次~5次，每次5 min，拍干。 C.3 然后用1% BSA封闭，