实验3-质粒DNA的提取.pptVIP

一、实验目的与背景 掌握碱裂解法提取质粒的原理 学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术 碱裂解法提取原理 （78页） 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来 三、仪器、材料与试剂 恒温培养箱 恒温摇床 台式离心机 高压灭菌锅 移液枪 含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌 含氨苄青霉素的LB液体培养基 溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ 70％乙醇 胰RNA酶 平衡酚 四、实验步骤 1. 将25mL含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基加入100mL锥形瓶中，接入含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜 2. 收菌，吸取1.5mL培养物加入1.5mL离心管中，4000r/min室温离心2min 3. 小心吸去培养液，将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽(细菌沉淀尽可能干燥) 4. 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀(涡旋振荡)，室温放置10min 5. 加入200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧盖子，快速温和颠倒离心管数次,以混匀内容物 (千万不要振荡),冰浴5分钟 6. 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧盖子，颠倒数次使混匀。冰上放置15min 7. 12000r/min离心15min，将上清转至另一离心管中 8. 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1），反复混匀，12000r/min离心5min，将上清转至另一离心管中 9. 向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置30min 10. 12000r/min离心5min，倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 11. 用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡，12000r/min离心5min，倒去上清液，空气干燥 12. 加20μL纯水或TE（含20μg/mL胰RNA酶），使质粒DNA完全溶解，－20℃保存 13 在下次实验中观察实验结果，通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 五、思考题 碱裂解法提取质粒的原理是什么？ 本实验中酚：氯仿的作用是什么？溶解质粒DNA时加入胰RNA酶的作用是什么？ 正确使用移液枪的要点有哪些？ 简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。 染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？ 溶液Ⅰ:悬浮细胞,抑制DNase 葡萄糖：增加溶液的粘度，悬浮菌体避免快速沉淀；维持渗透压，防止DNA受机械力作用而降解 EDTA：金属螯合剂，螯合Mg2+、Ca2+ 等二价金属离子，抑制DNase对DNA的降解作用。 溶液Ⅱ：裂解细菌，变性DNA和少量蛋白质 NaOH：破解细胞（瞬间溶解细胞膜，细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化），释放DNA，使蛋白质变性。DNA在pH大于5、小于9的溶液中是稳定的。但当pH﹥12或pH﹤3时，就会引起双链之间的氢键解离而变性。溶液II中的NaOH浓度为400mmol/L，加到提取液中时，该系统的pH12，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性 SDS：SDS是离子型表面活性剂。其主要功能是溶解细胞膜上的脂质和蛋白，因而溶解膜蛋白破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；SDS能与蛋白质结合使蛋白质变性而沉淀下来，为后续处理需要 溶液Ⅲ：使大部分蛋白质和细菌基因组DNA沉淀 实质是KAc-HAc的缓冲液 ，用pH4.8的KAc是为了把强碱性的提取液调回至pH中性，使变性的质粒DNA能够复性，并稳定存在。 高浓度KAc： SDS能与蛋白质结合，SDS与高浓度KAc生成PDS，PDS的溶解度比SDS低很多，从而使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被沉淀，使沉淀更完全 ；另外可中和核酸上的电荷，减少相斥力，利于变性的大分子染色体DNA、RNA互相聚合而沉淀下来。 无水乙醇：沉淀质粒DNA 乙醇可以任意比例和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的DNA沉淀剂 DNA溶液中DNA是以水合状态稳定存在的，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失去水而易于聚合 质粒DNA提取常见问题 * * 实验二：质粒DNA的提取 载体：基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。 载体按其行使的功能分为克隆载体和表达载体，按组成元件的来源不同分为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。 质粒（pBR322、pUC） 噬菌体 M13噬菌体 噬菌粒 pET 载体 克隆和表达外源基因 ;DNA 测序 构建基因文库和 c