《生物化学》实验讲义.pdfVIP

实验一 蛋白质及氨基酸的颜色反应 一、目的意义 1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理 1、双缩脲反应 当尿素加热到 180℃左右时， 2 分子尿素发生缩合放出 1 分子氨而形成双缩脲。双缩脲在 碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴 定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡 含有肽键的物质并不都是蛋白质。 2、茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及 α-氨基酸（除脯氨酸 和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。 该反应十分灵敏， 1:浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的 定量测定。 3、黄色反应 含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物） ， 再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。 OH + HNO 3 HO NO 2 + H O 2 OH HO NO 2 + NaOH O N OH 三、仪器与试剂 1、试剂 (1) 蛋白质溶液：取 10mL鸡蛋清，用蒸馏水稀释至 100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。 (2) 0.3%色氨酸溶液、 0.3%酪氨酸溶液、 0.3% 脯氨酸溶液、 0.5% 甘氨酸溶液、 0.5%苯酚溶液。 (3) 0.1 ％茚三酮－乙醇溶液：称取 0.1g 茚三酮，溶于 100mL 95％乙醇。 (4) 10 ％NaOH溶液、 1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。 2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。 四、操作方法 1、双缩脲反应 (1) 取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加 热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气 （可由气味辨别） 。待试管冷却， 加入约 1mL10 ％ NaOH 溶液，振荡使其溶解，再加入 1 滴 1％硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。 (2) 另取 1 支试管，加入 1mL 蛋白质溶液，再加入 2mL 10 ％NaOH 溶液摇匀，然后再加入 2 滴 1％的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。 (3) 注意事项 加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。 (4) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 2、茚三酮反应 (1) 取 3 支试管， 分别加入蛋白质溶液、 0.3% 脯氨酸溶液、 0.5% 甘氨酸溶液各 1mL ，再加 0.5mL 0.1％茚三酮－乙醇溶液，混匀后在小火上加热煮沸 1－2min ，放置冷却，观察颜色变化。 (2) 在滤纸的不同部位分别滴上一滴 0.3%脯氨酸溶液、 0.5% 甘氨酸溶液，风干后再在原处滴 一滴 0.1 ％茚三酮－乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察斑点出现及其颜色。 (3) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 3、黄色反应 向 6 个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。 管 号 1 2 3 4 5 6