石蜡组织的dna提取步骤.docxVIP

QIAamp DNA Mini Kit （50）, 货号： 51304 材料： 二甲苯 无水酒精 QIAamp DNA Mini Kit , 货号： 51304 （ ALT Buffer,, 蛋白酶 K，RNase A, AL buffer, QIAamp Spin Column, AW1buffer, AW2 buffer, AE buffer ） 一．提取具体步骤： 取不超过 25毫克的石蜡组织放在 1.5 毫升的离心管中（不提供）。 加1200卩I的二甲苯，震荡器剧烈混合（涡流）。 室温下14000rpm离心5分钟（15 - 25° C）。 用枪吸去上清，不要碰到下面的沉淀。 加1200ul的酒精（96-100%）,以便洗去残留二甲苯，用震荡机轻轻震 荡。 室温下14000rpm离心5分钟（15 - 25° C）。 用枪小心吸去酒精，不要碰到下面的沉淀。 重复 5-7 步。 放置一定时间（ 37度条件下孵育 10-15 分钟），直到酒精完全挥发。 把沉淀悬浮在180ul的ATL Buffer （如果缓冲液产生沉淀，需要在56度 中孵育溶解 ）中。 加20ul的蛋白酶K。用震荡器充分混合，56度孵育直到组织完全溶解。 （从孵育到组织的溶解过程中需要 不时振荡，不同组织溶解时间不同，通 常是1-3小时。样品可以反应 过夜，这不会影响DNA勺制备。为了保证有效的裂解， 应该在摇动的水浴或摇床上进行； 如果没有此条件， 可以在孵育过程中， 每小时 晃动2-3次）。 12?将1.5ul的离心管进行短暂离心，以便除去盖子内部的水滴。 13.继续步骤3a。（或者如果需要不含RNA勺基因组DNA继续步骤3b） 说明：转录活性组织如肝脏和肾脏，含丰富的RNA（将和基因组DNAr起被纯 化）。RNAT以抑制一些下游的酶反应，但是不会影响 PCR 3a加入200ulAL buffer到样品中，用脉冲震荡器震荡15s，短暂离心以便 除去盖子内部的水滴 ,70 度下孵育 10min，。 3b加入4 ul的RNase A（ 100mg/ml），脉冲震荡器震荡15s,在室温下孵育 2min,再加入200ulAL buffer ，通过脉冲震荡器再混合15s, 70度孵育10min,短 暂离心。 （样品和AL buffer充分混匀是很重要的。加入AL buffer可能会产生白色的 沉淀。在大部分情况下，沉淀能在 70度的孵育下溶解） 14?给样品加入200ul的酒精（96-100%）,脉冲震荡15s，短暂离心。 （样品、AL buffer和酒精彻底混匀是很重要的。加入酒精时可能会产生白色 的沉淀。把所有的沉淀用于 QIAampSpin Column是很重要的。沉淀不妨碍QIAamp 反应程序或者任何此后的应用。 ） 不要使用除了酒精之外的乙醇，因为这将会减少产量。 小心地把从步骤14获得的混合物（包括沉淀）倒在QIAamp Spin Column （一个2ml的收集管中），注意不要把边沿弄湿，扣好盖子，在 8000rpm下离心 1min。把QIAamp Spin Column放进干净的2ml收集管中（提供），丢掉含有虑出 液的管。 小心地打开QIAamp Spin Column的盖子，加入500ul的AW1buffer（不要 弄湿边沿）。盖上盖子，在8000rpm下离心1min，把QIAampSpin Column放在2ml 集液管中 （提供），弃去有滤液的管子。 小心地打开QIAamp Spin Column，加入500ul的AW2 buffer （不要弄湿 边沿）。盖上盖子，14，000rpm下离心3min。弃去有滤液的管子。 （可选择） 把QIAampSpin Column放在一个干净的2ml收集管［不提供］中， 14，000rpm下离心1min，弃去有滤液的管子。 把QIAamp Spin Column放在一个干净的1.5ml微分离心管［不提供］中， 小心地打开QIAamp Spin Column的盖子，并加入200ul （100?） AE buffer或者 蒸馏水。室温下孵育1min，然后8000rmpS心1min。 重复步骤 18。 （离心前把装有AE buffer或蒸馏水的QIAamp Spin Column孵育5min，—般 都会增加DNAr量） (在第三步中，用200ul的缓冲液AE额外进行洗涤，将使产量增加15%) 对于长期储藏的DN屎说，推荐在AE缓冲液中洗涤并且放在-20 C下。因为在 水中储藏的DNAJ能被酸水解。 DNA勺产量将依赖于处理过程中组织的数量和组织类型。25mg勺组织在400ul 的水(25-75ng/ul )中将产生大约10-30ug的DNA在A260/A280吸收比率为.7-1.9 。 kit concen t