生物化学第一章 蛋白质——氨基酸.pptVIP

(1)、氨基酸与茚三酮反应（颜色反应） + 3H20 茚三酮(无色) NH3 CO2 RCHO + 还原性茚三酮 紫色化合物 (弱酸) 加热 + 2NH3 + 水合茚三酮 还原性茚三酮 氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。 反应特点 A.该反应由NH2与COOH共同参与 B.茚三酮是强氧化剂 C.该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值（蓝色产物在570nm处有最大光吸收值） D. 测定范围：0.5~50μg/ml E.脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3）, 在440nm有最大光吸收值。 应用： A.在AA纸层析中用茚三酮作呈色剂 B.氨基酸自动分析仪 C.可根据此反应的灵敏度分析出肽链长短（越长则反应越不灵敏） （1）茚三酮反应 (2) 与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应（ Sanger 反应） 反应特点 A.为α- NH2的反应 B.氨基酸α- NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃) C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成黄色的二硝基苯氨基酸 意义： DNP-AA呈黄色，多肽和蛋白质N’末端的AA也可以与之形成DNP-多肽或DNP-Pr，之后使该多肽或蛋白质水解，酰胺键断裂，而DNP-AA键不断裂，可以用乙醚将其抽提出来（DNP-AA与其它AA在有机溶剂中溶解度不同），进行纸层析，根据在纸上黄色斑点的位置可鉴定N’末端的AA的种类 ★首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构 A.肽分子与DNFB反应，得DNP-肽 B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸 C.分离DNP-氨基酸 D.层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目 (3) 与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应 由Edman于1950年首先提出 为α- NH2的反应 用于N末端分析，又称Edman降解法 Edman （异硫氰酸苯酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽 环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸 分离PTH-氨基酸 层析法鉴定 异硫氰酸苯酯 苯氨基硫甲酰多肽 层析法种类多，操作越来越简便、快速和自动化，效果越来越灵敏、精确。是生化领域最为常规的技术。 一、层析法概述 层析分离法又称色层分离法，色谱法: 无论何种层析,都是由互不相溶的两个相组成:一是固定相(固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。 六、氨基酸的分离分析 分配色谱是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。 根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱可分为正相色谱和反相色谱。 正相色谱（Normal Phase Chromatography，NPC）的固定相为极性，流动相为非极性，当混合物随流动相通过固定相时，极性较强的化合物被保留，极性较弱的化合物先被洗脱下来。 反相色谱（Reversed Phase Chromatography，RPC），固定相为非极性，流动相为极性，用于分离非极性或弱极性物质。 分配系数(K)是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值： K=流动相中溶质的浓度/固定相中溶质的浓度 分配系数与溶剂和溶质的性质有关，同时受温度、压力的影响。所以不同物质的分配系数不同。而在恒温恒压条件下，某物质在确定的层析系统中的分配系数为一常数。 载体 ：纤维素 硅藻土 硅胶（柱、纸、薄层等形式） 应用：各种生化物质的分离鉴定 原理： 　　分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均匀地分配在两相中，各种组分按其各自的分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。 逆流分溶原理示意图 物质Y(Kd=1)的分配情况 溶剂 A 物质Z(Kd=3)的分配情况 溶剂 B 总量 总量 总量 总量 总量 总量 平衡后 转移 1 转移 2 转移 3 分