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流式双染测凋亡原理、过程和成果判别
一、原理：
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常坐落细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的前期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外表，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC）符号，以符号了荧光素（FITC）的Annexin-V作为荧光探针，运用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过无缺的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI可以穿透细胞膜而使细胞核红染，所以PI首要检测坏死或中晚期调亡细胞（二者的膜都发生了决裂）。因而将Annexin-V与PI匹配运用，就可以将前期凋亡细胞和中晚期以及坏死细胞区别开来。
二、过程：
1、无菌条件下获取新鲜的肝安排，置于事前消毒好的200目不锈钢细胞筛网上，下接50ml小烧杯。用眼科剪把安排剪成小块，眼科镊去除小血管及结缔安排，用玻璃棒悄悄研磨安排，使细胞掉落。待研磨充沛后，用5％预冷的RPMI-1640液冲刷，搜集小烧杯中单细胞悬液，随后以500-1000r/min离心5min ,弃上清。重悬、离心洗刷2次 ,以取得较纯化的肝细胞。将肝细胞悬液取样在光镜下用血细胞计数板计数，调理细胞数目至1×106 ∕ml。
2、取1ml单细胞悬液，用预冷的PBS洗刷两次，然后参加1×结合缓冲液1ml重悬细胞。
3、取100ul参加到5ml的培育管中，参加5ulFITC符号的Annexin-V和5ul PI，混匀后室温下避光孵育15min，然后再参加400ul的1×结合缓冲液。整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
4、反响结束后赶快在一小时内上机检测，用FL1通道检测FITC- Annexin V荧光，FL2通道检测PI荧光。一起以不加FITC- AnnexinV及PI的一管作为阴性对照。
三、成果判别：
凋亡中晚期的细胞和坏死细胞其胞膜有损害，PI可以穿透细胞膜而使DNA被PI着染发生赤色荧光。而细胞膜坚持无缺的前期凋亡细胞关于细胞活性判定的染料PI有抗染性，则不会有赤色荧光发生，正常活细胞与之类似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显现活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限对错活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，出现（FITC+/PI-）。
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