gstpulldown的原理以及具体操作流程_共2页.pdfVIP

实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互作用， 或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 实验原理：利用重组技术将探针蛋白与 GST （Glutathione S transferase ）融合，融合蛋白通 过 GST与固相化在载体上的 GTH （Glutathione ）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作 用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离 . 试剂： NaCl ， KCl ，Na2HPO4 ，KH2PO4 ，Triton-100 ， IPTG(Merck 分装 )， PMSF （Amersco ），Cocktaier （Merck 539134 ），Immobilized Glutathione （PIERCE 15160 ） 实验操作程序： 材料及试剂 探针蛋白与 GST 融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物 细胞蛋白裂解液，洗脱液： PBS及 PBS+1%Triton-100 PBS (1L) NaCl ： 8g KCl ： 0.2g Na2HPO4 ： 1.44g KH2PO4 ： 0.24g 加入 800ml 蒸馏水，用 HCl 调节溶液的 pH 值至 7.4，最后加蒸馏水定容至 1L 即可，高温 高压灭菌！ 4 ℃保存备用！ PMSF( 苯甲基磺酰氟 ) MW:174.19 工作浓度 0.1-1mM ，这里使用 1mM ，储存浓度 100mM ，将 0.174g PMSF 溶于 10ml无水乙醇混匀即可！保持于 -20 ℃或者 4 ℃ （以下流程仅供研究已知原核蛋白 A 和真核过表达蛋白 B相互作用） 1：原核融合蛋白 A 的获得 1.1：将编码蛋白 A 与 GST 的重组质粒化转 BL21(DE3) 菌株 1.2：挑取单个克隆到含有 5mlLB(+100ug/mlAmp) 的 10ml 试管里， 37℃培养过夜 1.3：将培养菌液转移到含有 500ml LB(+100ug/mlAmp) 的 1L锥形瓶中， 37℃，225rpm培养 至 OD600≈1.0 -1.5左右，加入适当浓度的 IPTG ，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需 要根据不同的蛋白做调整） .6000g， 10分钟， 4 ℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于 - 20℃放置 O/N 1.4：室温冻融菌体，马上置于冰上，每 500ml 培养液加入 10-20ml 细菌裂解液 （PBS+1%Triton-100+PMSF ），吹打混匀 1.5：冰上超声破碎，开 2秒，停 9秒，总 40-60分钟。至裂解液充分清凉 1.6： 11000rpm ， 15分钟， 4 ℃离心分离上清， -80 ℃保存备用 2：真核融合蛋白 B 的获得 2.1 ：将编码 B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白（如 HA, 或者 myc ）的真核表达载体上， 进行细胞转染 xq 3：48小时后，取适量融合蛋白 GST-A 冰上冻融 4：取 50-70ulGST-Beads （Immobilized Glutathione ）到 EP管中，用 800ul PBS+1%Triton- 100润洗一次，将冻融融合蛋白 GST-A 与之混匀， 4℃层析柜旋转结合 1小时。 5：PBS+1%Triton-100 洗 3次， PBS洗 3次。留取 20ul （ PBS+Beads）作 Offer 。 6：同时，裂解真核融合蛋白 B ，去尽培养基，用 PBS(RT)洗一次，加入 300ul裂解液（以 6well 为例， PBS+1%Triton-1