试验一植物组织总dna的提取及dna的浓度测定4学时.ppt

南京晓庄学院 生物实验教学中心 实验十一 植物组织总 DNA 的提取及 DNA 的浓度测 定 ? 掌握用 CTAB 法提取植物总 DNA 的方法和基本原理。 ? 学习利用紫外分光光度法测定 DNA 溶液的浓度。 一、实验目的 南京晓庄学院 生物实验教学中心 二、实验原理 通常采用 机械研磨 的方法破碎植物的组织和细 胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类 ( 尤其是氧化 酶类 ) 对 DNA 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲 液中需加入 抗氧化剂或强还原剂 ( 如巯基乙醇 ) 以降 低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎， 并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB, SDS 等离子型表面活性剂，能溶解细胞 膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使 DNA 得以 游离出来。 南京晓庄学院 生物实验教学中心 再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使 蛋白质变 性， 并使抽提液分相，因核酸 (DNA 、 RNA) 水溶性很强， 经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋 白质。上清液中加入 异丙醇或乙醇使 DNA 沉淀 ，沉 淀 DNA 溶于双蒸水或 TE 溶液中，即得植物总 DNA 溶液。之后可加入 RNA 酶降解其中的 RNA ，再用氯 仿除去 RNA 酶，得到较纯的 DNA 制剂。 南京晓庄学院 生物实验教学中心 ? DNA 的吸收光谱峰在 260 nm 处，据计算，测 定此波长下 DNA 溶液的 OD 值，当 OD 260 =1 时，双 链 DNA 含量约为 50 μ g/ml ，据此可用紫外分光光 度计测定溶液中 DNA 含量。 ? 由于 蛋白质 的吸收峰在 280 nm 处，在测定 DNA 含量时，还常计算 OD 260 /OD 280 之值，如该值 为 1.8-2.0 时，认为已达到较高的纯度，如低于此 值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。 南京晓庄学院 生物实验教学中心 水稻品种的幼苗叶片 三、实验材料 南京晓庄学院 生物实验教学中心 四、实验器具、药品试剂 水浴锅，研钵，微量移液器，枪头，离心管，台 式离心机，液氮，恒温箱，标签纸，紫外分光光度 计，磁力搅拌机，剪刀等。 2% CTAB 抽提缓冲溶液，异丙醇 , 氯仿 - 异 戊醇等 南京晓庄学院 生物实验教学中心 CTAB 法流程图 植物材料 裂解液 上层溶液 液氮研磨 抽提 细胞裂解 干燥溶解 离心洗涤 异丙醇沉淀 DNA 溶液 南京晓庄学院 生物实验教学中心 五、实验方法 (1) 2%CTAB 抽提缓冲液在 65 ℃ 水浴中预热。 (2) 取少量叶片（约 0.2 g ）置于研钵中，用液氮磨至粉状； (3) 在液氮挥发将尽而植物组织尚未解冻时迅即加入 700 μ l 的 2%CTAB 抽提缓冲液，轻轻搅动； (4) 将磨碎液分倒入 1.5 ml 的灭菌离心管中，磨碎液的高度约 占管的三分之二； (5) 置于 65 ℃ 的水浴槽或恒温箱中，每隔 10 min 轻轻摇动 ， 40 min 后取出； 1. DNA 的提取 南京晓庄学院 生物实验教学中心 （ 6 ）冷却 2 min 后，加入氯仿 - 异戊醇（ 24 ： 1 ）至 满管，剧烈振荡 2~3 min ，使两者 混合均匀 ； （ 7 ）放入离心机中 10 000 rpm 离心 10 min ，与此 同时，将 600 μ l 的异丙醇加入另一新的灭菌离心管 中； （ 8 ） 用移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙 醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动 30 sec ，使 异丙醇与水层充分混合至能见到 DNA 絮状物； 南京晓庄学院 生物实验教学中心 （ 9 ） 10000 rpm 离心 1 min 后，立即倒掉液体，注 意勿将白色 DNA 沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的 纸巾上； （ 10 ） 60 sec 后，直立离心管，加入 720 μ l 的 75% 乙醇及 80 μ l 5 M 的醋酸钠， 轻轻转动 ，用手指弹管 尖，使沉淀与管底的 DNA 块状物浮游于液体中； （ 11 ）放置 30 min ，使 DNA 块状物的不纯物溶解； （ 12 ） 10000 rpm 离心 1 min 后，倒掉液体，再加 入 800 μ l 75% 的乙醇，将 DNA 再洗 30 min ； 南京晓庄学院 生物实验教学中心 （ 13 ） 10000 rpm 离心 30 sec 后，立即倒掉液体， 将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离 心管，干燥 DNA （自然风干或用风筒吹干）； （ 14 ）加入 50 μ l 0.5 × TE( 含 RNase) 缓冲液，使 DNA 溶解，置于 37 ℃ 恒温箱约 15 h ，使 RNA 消解； （ 15 ）置于 -20 ℃ 保存、备用。 南京晓庄学院 生物实验教学中心 称取样品