（完整版）胶体金免疫试验探析.docx

关注我 实时更新 最新资料 胶体金免疫试验探析 一、胶体金免疫结合试验 的检测原理胶体金免疫结合试验 的检测原理是以微孔滤膜为载体,包被已知抗原或抗体,加入待检标本后,经滤膜 的毛细管作用使标本中 的抗体或抗原与膜上包被 的抗原或抗体结合,再通过胶体金结合物达到检测目 的。根据检测装置 的不同可分为金免疫渗滤试验(GIFA)和金免疫层析试验(GICA)。1·GIFA:GIFA始于1985年[1],最初以酶作为标记物。1989年发展了以胶体金为标记物用于检测艾滋病病毒抗体 的渗滤试验[2],确立了GIFA 的基本技术。GIFA试剂盒有2个主要成分:一是金标抗体结合物,另一是渗滤装置。该装置为一充满吸水垫料 的塑料小盒,在盒盖中央 的小孔下面放置了一片硝酸纤维素膜,膜上预包被抗原或抗体斑点。试验时将标本滴加在膜上,通过渗滤使抗原抗体在膜上发生免疫结合反应;再滴加金标结合物,使其与对应抗体抗原结合并显色。阳性结果在膜上出现着色斑点。GIFA检测操作步骤与酶联免疫吸附试验(ELISA)法相同。差别在于加样、反应和洗涤均通过渗滤完成。检测全过程仅需数分钟,但敏感度却与需数小时完成 的ELISA相仿。其原因在于:ELISA样品中 的待检抗原需缓慢地扩散才能与吸附于固相表面 的抗体反应,而在膜渗滤法中,抗体充满了膜 的微孔,待检液体层层渗滤时抗原抗体紧密接触形成免疫浓缩,从而提高了反应效率。另外,以胶体金作为标记物,不但减少了操作步骤,而且试剂可在室温长期保存。2·GICA:1990年Oskiowicz等[3]应用硒作为标记物建立了免疫层析试验。其后一般均采用简便 的胶体金试验。其检测原理与GIFA相同,不同点在于液体 的移动不是通过直向 的穿流,而是基于层析作用 的横向流动。GICA是将各种反应试剂以条带状固定在同一试纸条上,待检标本加在试纸条 的一端,将一种试剂溶解后,通过毛细作用在层析条上渗滤、移行并与膜上另一种试剂接触,样品中 的待测物同层析材料上针对待测物 的受体(如抗原或抗体)发生特异性免疫反应。层析过程中免疫复合物被截留、聚集在层析材料 的一定区域(检测带),通过可目测 的胶体金标记物得到直观 的显色结果。而游离标记物则越过检测带,达到与结合标记物自动分离之目 的。GICA特点是单一试剂,一步操作,全部试剂可在室温长期保存。这种新 的方法将胶体金免疫检测试验推进到一个崭新 的阶段。二、GICA试剂 的制作1·试剂:为试纸条形式。在试纸条 的塑料片上依次粘贴如下组分:(1)吸水纸(加样区),(2)玻璃纤维膜,膜上吸附着干燥 的金标抗体(流动带),(3)硝酸纤维素膜,膜上包被着抗原或抗体条带和能与标记物直接起反应 的质控物条带(检测带),(4)吸水纸。以上各组份首尾互相衔接。因此在(1)处滴加液体标本,液流即向(4)处移动。当液体到达(2)处时,金标抗体被溶解,同时与标本中 的抗原反应形成复合物。液流继续前移至(3)时,带有金标记 的复合物被膜上 的抗体捕获,呈现红色 的线条。未结合 的金标抗体继续前移至(4)处。2·GICA制作中须注意 的几个问题:GICA检测 的可靠性主要依赖于所用试剂 的质量。其中层析材料 的选择、处理以及受体固定是免疫层析条研制 的关键技术。微孔滤膜:层析反应是以滤膜为载体,所以滤膜 的质量致关重要。其吸附性能、过滤速度等均会影响检测结果。有些滤膜很难达到各部分性质均一 的质量,因此,应仔细筛选优质滤膜。可选择 的滤膜除硝酸纤维膜外还有尼龙膜、羧化纤维素膜、聚酯膜、纯纤维素膜和玻璃纤维膜等多种类型,但硝酸纤维素膜(NCM)运用较多。这主要得益于NCM 的2个特性:较高 的蛋白吸附容量和良好 的亲水性。纯纤维素膜和羧化纤维素膜也是免疫层析 的常用材料,但一般要求预先对其作化学处理,使其具有与受体蛋白共价联接 的特性。常用 的处理方法有苯醌法[4]、溴化氰法[5]和碳二亚胺法[6]。受体:固定于滤膜 的受体要求具备如下几点性质:(1)与膜材料 的结合稳定性好;(2)有较高 的生物活性,因而有足够 的配体捕获容量;(3)有较高 的纯度,此为特异性检测 的基础;(4)对于以干态吸附于流动带 的标记或非标记受体,其可流动性是评价其性能优劣 的主要指标。往往要求在流动带加入高效助溶剂,从而使吸附于流动带 的受体具有快速溶解 的特性。受体固定工艺:受体固定工艺应简单、有效。如大规模生产应采用机械喷膜,保证制膜快速、稳定、一致。受体包被量:筛选最佳 的受体包被量是提高检测敏感度 的重要因素之一。在不影响所需灵敏度 的前提下可提高固相抗原或抗体 的浓度,扩展测定 的线性范围,以减少钩状效应。另外,有些检测项目如血清肌红蛋白、肌钙蛋白和甲胎蛋白等阳性质控 的阈值高低与检测 的敏感性和特异性密切相关。这类检测