组培褐化现象的原因分析及防治措施.docx

褐变又称褐化，是指培养材料向培养基释放褐色物质，致使培养基逐渐褐变，培养材料也随之变褐甚至死亡的现象。 褐化产生的机理可查看 引起褐变的原因 1.1 植物的种类和基因型 不同植物、同种的不同类型、同种的不同品种的植物发生褐变的程度，都具有很大的差异，这取决于植物体内含有的酚类物质多少以及酚氧化酶活性的强弱。 1.2 外植体的类型和生理状态 由于植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶活性在不同季节不相同，一般在生长季节含有较多的酚类化合物，所以一般在早春或秋季取材。 通俗的说长的久又老的部位含酚类物质要多，所以一般选取幼龄嫩茎部位作为外植体。 1.3 外植体的大小和消毒时间 部分实验证明，外植体材料越小越容易发生褐变，同样各种化学消毒剂消毒时间过长也会加重褐变现象，特别是酒精，时间不宜过长。还有外植体的切口大小也会影响褐变，切口宜小不宜大。 1.4 光照和温度 光照会提高多酚氧化酶的活性，从而促使培养物的褐变。故在初代培养中，对外植体进行暗光培养，对抑制褐变发生有一定的效果。 同时，高温能促进酚类物质的氧化；低温能抑制酚类物质的合成，降低多酚氧化酶的活性，从而减轻褐变。 所以，如有褐变情况的发生，可适当降低培养温度，以及遮光或暗光培养一段时间。 1.5 培养基成分 无机盐以及细胞分裂素浓度过高也会影响褐变。 克服褐变现象的措施 从理论上讲，酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制：一是除去引起氧化的物质 —— 氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。 由产生褐变的原因可知，选择适宜的外植体以及最佳培养条件，可从根本上减少褐变的概率。实际操作中，下列措施被认为是行之有效的。 2.1 选择适当的外植体 选择生长旺盛的，分生能力强的部位作为外植体材料，在进行组织培养过程中不易产生褐变。油棕用幼嫩的外植体培养时褐变较轻，而用高度分化的叶片接种后，褐变严重。在取材时还应注意外植体的基因型，选择褐变程度较小的品种作为外植体。 2.2 培养材料进行预处理 将外植体用流水冲洗后，在 5℃左右处理 12-24 小时，消毒后先接种在只含有蔗糖的培养基 上 5-7 天，使组织中的酚类物质部分先渗入培养基。取出外植体，用适当方法清洗，再接种到适合的培养基上，可减轻外植体的褐变。 2.3 选择适当的培养基和培养条件 在培养基的选择上应注意适当的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平与组合以及配合一些抗褐变剂等都可减轻褐变现象的发生。 培养过程中还要注意适宜的培养条件，因为在酚类物质的合成和氧化过程中，有许多酶系统参与，其中部分酶系统是光活性的。较高的温度会使酶促褐变加强。 所以建议在培养初期保持较低的温度 (15～20℃) ，黑暗或弱光下培养，均可减轻培养材料的褐变。 2.4 抑制剂和吸附剂的作用 在培养基中加入抗氧化剂和其他抑制剂可以有效地减轻外植体在组培过程中的酶促褐变。 在培养基中加入抗坏血酸（ Vc ）50-100mg/L 可有效的防止褐变。这是因为 Vc 为多羟基还原物质，一方面可以使多酚氧化酶失活阻止酚类物质氧化；另一方面 Vc 在酶的催化下能消耗溶解氧，使酚类物质因缺氧而无法氧化。 活性炭是一种较强的吸附剂，它可以吸附培养物分泌到培养基中的酚、醌等有害物质，从而有效地减轻褐变。 需要注意的是，活性炭在吸附有害物质的同时也吸附培养基中的生长调节物质，而使其失去作用，影响外植体的正常发育。因此，在加入活性炭的培养基中应适当改变激素配比，使得在防止褐变的同时，外植体能够正常的发育。 2.5 其他防止褐变的措施 在外植体接种后 1-2 天即转移至新鲜培养基中或同一培养基的不同部位，可以防止酚类物质在伤口周围积累过多，连续转移几次即可防止褐变。 此外，在外植体的培养过程中适当缩短转瓶周期，适当改变培养基的硬度等方法均可减轻褐变的毒害。