rna的提取和cdna合成原理和实验方法.docxVIP

RNA 的提取与 cDNA 合成原理与实验方法 第一节、 概述 从真核生物的组织或细胞中提取 mRNA, 通过酶促反应逆转录合成 cDNA 的第一链与第 二链 ,将双链 cDNA 与载体连接 ,然后转化扩增 , 即可获得 cDNA 文库,构建的 cDNA 文库可用 于真核生物基因的结构、表达与调控的分析 ;比较 cDNA 与相应基因组 DNA 序列差异可确 定内含子存在与了解转录后加工等一系列问题。总之 cDNA 的合成与克隆已成为当今真核 分子生物学的基本手段。自 70 年代中叶首例 cDNA 克隆问世以来 ,已发展了许多种提高 cDNA 合成效率的方法 ,并大大改进了载体系统 ,目前 cDNA 合成试剂已商品化。 cDNA 合成 及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成 cDNA 第一链 ,聚合酶合成 cDNA 第二链 ,加入合成接 头以及将双链 DNA 克隆到于适当载体 (噬菌体或质粒 )。 一、 RNA 制备 模板 mRNA 的质量直接影响到 cDNA 合成的效率。由于 mRNA 分子的结构特点 ,容易 受 RNA 酶的攻击反应而降解 ,加上 RNA 酶极为稳定且广泛存在 , 因而在提取过程中要严格防 止 RNA 酶的污染 ,并设法抑制其活性 , 这就是本实验成败的关键。所有的组织中均存在 RNA 酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染 ,因此全部实验过程中均需戴手套操作并经 常更换(使用一次性手套)。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中 200C烘烤2小时以上。凡就 是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用 0、1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，再 用蒸馏水冲净。 DEPC 就是 RNA 酶的化学修饰剂 ,它与 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环 反应而抑制酶活性。 DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物 ，因而使用时需小心。试验所用试 剂也可用 DEPC 处理，加入 DEPC 至 0、1%浓度，然后剧烈振荡 10分钟，再煮沸 15分钟或高压 灭菌以消除残存的 DEPC,否则DEPC也能与腺嘌呤作用而破坏 mRNA活性。但DEPC能与 胺与巯基反应 ，因而含 Tris 与 DTT 的试剂不能用 DEPC 处理。 Tris 溶液可用 DEPC 处理的水 配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌 ,可用 DEPC 处理水配制 ,并尽可能用未曾开 封的试剂。除 DEPC 外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、 RNA 酶抑制蛋白等。此外 , 为了避免 mRNA 或 cDNA 吸附在玻璃或塑料器皿管壁上 ,所有器皿一律需经 硅烷化 处理。 细胞内总 RNA 制备方法很多 ,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总 RNA 提 取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总 RNA。分离的总RNA可利用mRNA 3末端含有 多聚(A)+的特点，当 RNA流经oligo (dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的 吸附在 oligo(dT) 纤维素上 ,然后逐渐降低盐浓度洗脱 ,在低盐溶液或蒸馏水中 ,mRNA 被洗下。 经过两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的 mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70C可保 存一年以上。 二、 cDNA 第一链的合成 所有合成 cDNA 第一链的方法都要用依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶 (反转录酶 )来催化反 应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒 (AMV) 逆转录 酶与从表达克隆化的 Moloney 鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病 病毒 (MLV) 反转录酶。 AMV 反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基 ，这些活性包括 依赖于 RNA 的 DNA 合成 ，依赖于 DNA 的 DNA 合成以及对 DNA:RNA 杂交体的 RNA 部分 进行内切降解 (RNA 酶 H 活性 )。 MLV 反转录酶只有单个多肽亚基 ，兼备依赖于 RNA 与依赖 于 DNA 的 DNA 合成活性 ，但降解 RNADNA 杂交体中的 RNA 的能力较弱 ，且对热的稳定性 较 AMV 反转录酶差。 MLV 反转录酶能合成较长的 cDNA( 如大于 2-3kb)。 AMV 反转录酶与 MLV 反转录酶利用 RNA 模板合成 cDNA 时的最适 pH 值，最适盐浓度与最适温室各不相同 ， 所以合成第一链时相应调整条件就是非常重要。 AMV 反转录酶与 MLV 反转录酶都必须有引物来起始 DNA 的合成。 cDNA 合成最常用 的引物就是与真核细胞 mRNA分子3端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。 三、 cDNA 第二链的合成 cDNA 第二链的合成方法有以下几种 : 1、 自身引导法 合成的单链 cDNA