从细胞中提取rna的方法.docx

从细胞中提取 RNA 的方法 从细胞中提取RNA的方法 加入800ul的Trizol将细胞悬浮起来，在室温下（15-30 °）用手 摇均，放置 5 分钟以上； 涡旋 30 秒后，将样品轻离至底部，加入 160ul 的氯仿，再涡旋 30 秒，室温放置 2-5 分钟； 用4°C离心机，13000rpm离心15分钟，使样品分层； 将最上面的水相溶液层转移到新的 1.7ml 离心管中，加入 2ul 的 糖原 Glucogen； 再加入400ul冰上预冷的异丙醇Isopropanol ,摇均。-20 °C放置 1 小时或过夜； 用4 °C离心机，13000rpm离心15分钟，弃上清； 力口 200ul 75% 无RNase酶的酒精洗 RNA 13000rpm离心15分钟； 弃上清，尽量不要碰到 RNA Pillet ； 在超净台上，干燥大约 8 分钟； 用无RNase酶的去离子水或是 DEPC Water溶解RNA在室温下 静置10分钟，待RNA完全溶解，保存在-80 °C （或是立刻做RT-PCR 翻转成cDNA保存在-20 °）。 注：In 1ml Trizol 5-10 x 10八6 cells ； 1 x 10八7 bacterial cells. At RT, lysis 5 mins. 从细胞中提取RNA的方法 特点 Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总 RNA该方法对少 量的组织(50-100 mg和细胞(5 X 106)以及大量的组织( 1 g)和细胞(107)均有 较好的分离效果。TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有 的操作可以在一小时内完成。TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。 故而能够作RNA印迹分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护 分析和分子克隆。如果是用于 PCR当两条引物位于单一外显子内时，建议用级 联扩大的DNase l(Cat. No. 18068) 来处理抽提的总 RNA并且利用DNA RNA 和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的 RNA 上层)、DNA(中层)、蛋白质(下层)分离纯化出来，效率极好。 Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种 RNA勺析出。例如，从大鼠 肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳 并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb 之间不连续的高分子量条带，(mRNA口 hnRNA成分)两条优势核糖体RNA条带 位于 ~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量 RNA介于 0.1 和 0.3 kb 之间(tRNA, 5S)。当抽提的RNA用 TE稀释时其A260/A280比值》1.8 折叠编辑本段使用方法 样品的制备 当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪 组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。 匀浆化后在2—8°C的条 件下以12,000 Xg的离心力离心10分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉 淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量 DNA而上层的超浮游物含有 RNA 在来自于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最上层因而应该除掉。 在每一个个 案中，将清亮的匀浆溶液转移到一干净的试管中加入氯仿并继续进行下述的分离 步骤。 分离阶段 将匀浆样品在15—30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分 解。每1 ml TRIZOL加0.2 ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管 15秒并 将其在30°C下孵育2—3分钟。在2—8°C下以不超过12,000Xg的离心力高 速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层， 上层无色的水样层。RNA无 一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所 加 TRIZOL容量的 60% RNA勺沉淀将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离 DNA和蛋白，有 机层同样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀 RNA最初均化时的每 1 ml TRIZOL对应0.5 ml异丙醇。将混合的样品在15— 30°C条件下孵育10分 钟并在2— 8°C下以不超过12,000 Xg的离心力高速冷冻离心10分钟。RNA沉 淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。 从细胞中提取RNA的方法 4 .RNA的洗脱 移去上层悬液。用75%勺乙醇洗涤RNA沉淀一次，每1 ml的TRIZOL 至少加1 ml的75%S醇。旋涡振荡混合样品并在 2— 8°C下以不超过7,500 Xg 的离心力高速冷冻离心5分钟。 5. RNA勺再溶解 在操作的最后，简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5—10 分钟）不要在真空管里离心干燥 RNA尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥