第十节诱变育种.pptVIP

第六节 原生质体育种;与正常细胞相比，原生质体具有一些新的独特的特性 ;以微生物原生质体育种的常见的育种方法有：一、原生质体再生育种二、原生质体诱变育种三、原生质体转化育种四、原生质体融合育种;;2、产生比常规诱变还高的正变率，其原因有以下方面： （1）原生质体比较敏感，制备和再生过程中的各种化合物及环境中的物理因子对染色体或质粒DNA都有一定诱变效应。 （2）原生质体再生本质上是细胞壁重建和分裂能力的恢复的过程，再生的细胞壁在组成和结构上发生变化，甚至于产生有利于细胞代谢产物分泌的变异。;（3） （4）原生质体再生材料无需经过遗传标记，减少了对菌株的损伤和优良性状的菌株。;3、实例： 弗氏链霉菌再生后，泰乐菌素产量提高3倍 产二素链霉菌再生后，螺旋霉素产量提高2倍 原因可能为13%-85%的质粒脱落， 解除抗生素 的调节机制。;4、原生质体再生育种一般程序 ;二、原生质体诱变育种;;3、原生质体诱变一般程序 ;出发菌株的培养和原生质体制备;三、原生质体转化育种;2、影响原生质体转化的因素 ①融合促进剂PEG来源、批号及聚合度。 ②制备原生质体的菌丝年龄、菌丝生长条件、原生质体再生条件。 ③转化时，质粒及原生质体的浓度。 ④再生培养基的组成。 ;4、原生质体转化一般程序 ;原生质体融合（protoplast fusion）20世纪70年代发展起来的基因重组技术。 Fodorhe Schaeffer于1976年分别报道了巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种内原生质体融合，微生物融合现象得到证实，并建立了相应的试验体系。; 原生质体融合： 指亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。在再生成细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。;1、大幅度提高亲本之间的重组频率 2、扩大重组的亲本范围 3、原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状计划更大。 ; 不足之处是原生质体融合后DNA交换和重组是随机的发生，增加重组体分离筛选的难度。 此外细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及遗传物质非同源性等因素也会影响原生质体融合的重组频率，使远缘融合存在较大困难。 ;二、原生质体融合育种程序;（一）直接亲本及遗传标记的选择;标记：营养缺陷型，抗性 热致死（灭活）孢子颜色菌落形态 遗传分析：采用营养缺陷型，抗性 提高产量：热灭活 荧光染色标记 ;（二）原生质体的制备与再生;; （1）影响原生质体制备的因素;;④稳定剂 原生质剥离细胞壁，对渗透压敏感，要在高渗溶液中酶解。 作为稳定剂的有： 无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2 有机物：糖和糖醇，如蔗糖、甘露醇、山梨醇。 试验表明： 无机盐对丝状真菌效果好 糖和糖醇对酵母更合适 细菌采用蔗糖或NaCl;⑤酶解前的预处理 在用酶处理前，根据细胞壁的不同结构加入某些物质先行预处理，以抑制或阻止某一种细胞壁成分的合成，从而有利于酶的渗入。 试验表明： SH-化合物广泛应用于酵母菌和某些丝状真菌，效果好 腐霉中，加入TritonX-100或脂肪酶后，可以除去细胞壁上的脂层，促进酶进入细胞壁。 酵母菌常用EDTA或EDTA加巯基乙醇。 放线菌培养液加入0.2%~4%甘氨酸。 细菌加入亚适量的青霉素。;⑥酶系和酶的浓度 细菌－溶菌酶（lyxozyme） 放线菌－溶菌酶（lyxozyme） 真菌－蜗牛酶（snailase） 用于水解细胞壁的酶浓度要适当， 酶量过低，作用不彻底，不利于原生质体形成，浓度过高，处理时间长，会影响原生质体数量和活性，致使再生频率下降。;⑦酶的作用温度和作用pH 通常大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，水解细胞壁的温度35℃，一般放线菌在30-32 ℃，产黄青霉采用蜗牛酶和纤维素酶维持在28-33 ℃须霉25 ℃酵母菌多在28-30℃ 。;;加蒸馏水之前 A 加蒸馏水之后 B 原生质体形成率＝（Ａ－Ｂ）／Ａ 　　　Ａ－加蒸馏水之前溶液中细胞数 Ｂ－加蒸馏水之后溶液中细胞数 即未形成原生质体的细胞数。 把加入蒸馏水前后的混合液分别涂布到高渗再生培养基中，计算菌落数。;（２）原生质体的鉴定;（３）原生质体的收集和纯化;（4）原生质体的活力的鉴定;（5）原生质体保存;2、原生质体再生;（1）再生的影响因素;;再生率的计算; (三