生化试验-血清醋酸纤维素膜电泳整理.ppt

血清醋酸纤维素 薄膜电泳 实验三 ? 电泳技术 ? 分光光度技术 ? 层析技术 ? 离心技术 生物化学的四大研究技术 ： 电 泳 技 术 ? 带电粒子在电场中移动的现象称为 电泳 。 ? 电泳技术 即是利用样品中各种带电粒子的带电性 质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移 速度不同，从而对样品分子进行分离、鉴定、纯 化和制备。 ? 在生物医学领域，该技术多用于分离，纯化、鉴 定蛋白质、核酸等大分子物质。 Kaurin Tiselius (1902- 1971) 因研究电泳和吸 附分析，特别是发现 关于血清蛋白的复杂 本质而获奖 1948 诺贝 尔生理医学奖。 ? 1809 年，俄国物理学家 Peиce 首次发 现电泳现象； ? 1937 年 ， Kaurin Tiselius 发 明 了 Tiselius 电泳仪，建立了自由界面电泳， 首次证明人血清蛋白的组分； ? 1948 年， Wieland 和 Fischer 以滤纸作 为支持介质的电泳； ? 1959 年， Raymond 和 Weintraub 利用 人工合成凝胶作为介质 —— 聚丙烯酰 胺 凝 胶 电 泳 : 生 物 大 分 子 的 “ Last Check” ！ （－） （ + ） ---------------------------- 表面带负电荷 ++++++++++++++++ 带正电荷的水层 （－） （ + ） +++++++++++++++++ 表面带正电荷 --------------------------- 带负电荷的水层  + + 电泳的影响因素： 1 、影响电泳迁移率的外界因素： ? 电场强度 ? 溶液的 pH 值 ? 溶液的离子强度 ? 电渗现象 2. 影响电泳迁移率的内在因素： ? 质点所带净电荷的量 ? 质点的大小和形状 电泳的分类 ? 根据电泳中是否使用支持介质分为： 自由界面电泳 区带电泳 ? 根据电泳系统 pH 是否连续分为： 连续 pH 电泳 不连续 pH 电泳 ? 按支持物的装置形式不同 分为： 水平板式电泳 垂直板式电泳 垂直柱式电泳 ? 根据电泳物质类别不同分为： 细胞电泳，核酸电泳， 蛋白质电泳 等 ? 按其介质的物理性状不同可分为： 凝胶电泳 粉末电泳 线丝电泳 纤维膜电泳 等 血清醋酸纤维素薄膜电泳 基 本 原 理 ? 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血 清蛋白。 ? 血清中含有清蛋白、 α - 球蛋白、 β - 球蛋白、 γ - 球 蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、 分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度 不同。 ? 以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在 pH8.6 的缓冲体系中电泳，染色后可显示 5 条区带。 其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为 α1 - 、 α2 - 、 β - 及 γ - 球蛋白。 试剂 巴比妥缓冲液，染色液，漂洗液 材料 血清，醋酸纤维素薄膜 器材 电泳仪，培养皿，点样器，玻璃板 粗滤纸，铅笔，加样枪，镊子等。 试剂和耗材 操作步骤 1. 准备 醋酸纤维素薄膜的预处理： 将薄膜小心放入盛有缓冲液的培养皿内，使其 漂浮在液面；用镊子轻压，使其全部浸入缓冲液内。 待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤 纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出 光滑 面 和 粗糙面。 标记： 在 粗糙面 上用铅笔距薄膜条一端 1.5cm 处划 线即为点样线并作好标记。 2. 点样（关键） 在薄膜的 粗糙面点样 。点样时，先用吸管 将 3 微升血清 均匀 地涂在点样器表面，再用点样 器“印”在薄膜的点样区内，样品呈线状，宽约 1~2mm 。 注意： 点样时动作要 轻 、 稳 ，用力不能太大，以免损坏 膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果 。 另外操作过程要防止指纹污染。 3. 电泳 将点样后的薄膜使 粗糙面（点样面）向下 ， 点样 端置于负极 ，贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上，平 衡 5min 。 打开电源，调节电压和电流强度。调节电压至 90- 100V 左右，电流强度为 0.4 ～ 0.6mA/cm 薄膜条宽， 电泳时间 40min-1h 左右。 1. 滤纸桥 2. 电泳槽 3. 醋酸纤维素薄膜 4. 电泳槽膜支架 5. 电极室中央隔板 点样端 4. 染色 电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中， 染色 5min 。 5. 漂洗 用漂洗液漂洗，不停摆动薄膜条，每 3-5min 左右换一次液，连续更换三次，可使背景颜色脱 去。将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。 操作中，注意控制染色和漂洗的时间，防止 背景过深或某些区带太浅。 分清薄膜的点样面 注意点样样品的宽度和力度 注意薄膜放置的方向 控制染色及漂洗时间 保持良好的实验秩序 6 、注 意 事 项 预期结果 一