单克隆抗体与基因工程抗体制备工作.pptVIP

;抗体种类： 第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody);杂交瘤技术的基本原理;基本概念;杂交瘤技术的理论基础;杂交瘤技术的基本原理;流 程;不产生Ig的重链和轻链 HGPRT-;TK- 与提供淋巴细胞的动物品系相同; 动 物： BALB/c小鼠 7～12周龄 20g～25g体重 ;细胞性抗原： （1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次 可溶性抗原： 首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫;细胞融合剂： PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同;骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3-10) 50% PEG 1min内加完; 10ml培养液终止反应;SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～5 1ml 50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置45秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用 根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7-14天，换用HT培养液;7～20天出现克隆 HAT筛选 挑克隆;HAT培养基： H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA;HAT选择作用： 淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻;杂交瘤细胞： 长期生长繁殖 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力;有限稀释法 特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞; 单克隆抗体的制备;一、单克隆抗体的产生;腹腔注射法;盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析;Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀???度表示? 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞?争抑制法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot;四、单克隆抗体的特性;优点 ： 在体外“永久”地存活并传代 用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗; McAb PcAb 抗原要求 可以不纯 纯度高 得量 高 低 特异性 高 低 　　 稳定 　　低 高 沉淀反应 无 有 成本 高 低 ;McAb and PcAb;基因工程抗体制备; 将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体;Fab：抗原结合片断 Fv：可变区片段 ScFv：单链可变区片段 SdAb：单区抗体 ;其它生物活性蛋白融合;　 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。;定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性;原理与操作技术;基因工程的操作技术; PCR(聚合酶链式反应);