蛋白质沉淀的技术.ppt

+ 蛋白质是人体机能构成成分 , 人体任何器官 和组织都是以蛋白质作为重要组成成分。 鉴于蛋白质重要性研究蛋白质分离十分必 要。 + 蛋白质表面有一些亲水基团易起水合作用， 从而形成水化层，导致蛋白质颗粒不易聚 集沉淀，这些蛋白质分子直径在 2 ～ 20nm 范 围，所以蛋白质溶液是亲水胶体，具有半 通透性，丁达尔效应、布朗运动等一些亲 水胶体性质 ① 。 [1] 杨丰科 . 系统有机化学 [M]. 北京 : 化学工业出版 社 ,2003· 433 一 435. + 蛋白质可解离基团包括末端α - 氨基和末端 α - 羧基及可解离侧链 R 基。这些可解离基 团在特定的 PH 范围内解离，产生带正电荷 或者带负电荷的基团。当溶液 PH 使蛋白质 所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋白质 分子本身净电荷为零，此时 PH 即为该蛋白 质分子等电点，用 PI 表示，测 PI 时一定在 缓冲液中进行，因为离子强度可以使 PI 改 变 ① 。 [1] 杨丰科 . 系统有机化学 [M]. 北京 : 化学工业出版 社 ,2003· 433 一 435. + 沉淀 是指在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解 度降低，形成固相从溶液中析出从而达到 分离的一种技术。 + 沉淀分离方法和其他分离方法相比，优点 是过程简单、成本低、原料易得，便于小 批量生产，在产物浓度愈高的溶液中沉淀 越有利、收率越高；缺点为过滤困难、产 品质量较低，需重新精制。 + 天然蛋白质受物理或化学因素影响，蛋白 质分子内部维系其高级结构原有氢键、盐 键等次级键遭到破坏，使分子内部结构发 生改变，导致其生物学性质、物理化学性 质改变，这种现象称为蛋白质 变性 作用。 + 变性蛋白质分子相互凝聚或相互穿插缠绕 在一起的现象称为蛋白质 凝固 ，例如生鸡 蛋蛋白溶液受热变为蛋白块现象。 + 蛋白质颜色反应实际上是氨基酸一些基团 肽键等与一定试剂所产生化学反应。 + 蛋白质胶粒上同性电荷互相排斥，不易凝 聚成团下沉；蛋白质表面许多亲水基团水 合作用形成一层水化膜 , 在胶粒之间起隔离 作用，蛋白质在水溶液中 , 虽分子量很大 , 但仍能维持稳定溶解状态。若能除去其水 化膜并中和其电荷 , 则蛋白质可从溶液中沉 淀而出。常用有以下几种沉淀方法： + 1 、盐析法 + 2 、有机溶剂沉淀法 + 3 、等电点沉淀法 + 4 、变性沉淀分离技术 + 5 、复合盐沉淀法 一般来说 , 所有固体溶质都可在溶液中加入中性 盐而沉淀析出 , 这一过程称之 盐析 ② 。 （ 1 ）中性盐沉淀蛋白质的基本原理 a. 高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低， 静电排斥作用减弱。 b. 中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋 白质争夺水分子。 [2] 李冬梅 , 张锦茹 , 田 园 . 蛋白质沉淀分离 [J]. 粮食与油 脂 ,2007· 9 一 11 盐析机理示意图 （ 2 ）中性盐的选择原则 a. 要有较强的盐析效果。 一般来说，阴离子影响盐析的效果比阳离子显著，且含高价阳 离子的无机盐比含低价阳离子的无机盐效果好。 b. 要有足够大的溶解度，且溶解度受温度影响尽可能地小。 便于获得高浓度的盐溶液，尤其是在低温时，不至于造成盐结 晶的析出。 c. 不影响蛋白质等生物大分子的活性， 并且，最好不引入给分离或测定 带来麻烦的杂质。 d. 来源丰富，价格低廉。 常用的中性盐有： (NH4) 2 SO 4 ， Na 2 SO 4 ， NaH 2 PO 4 等。其中 最重要的是 (NH4) 2 SO 4 。 优点： ①溶解度大 ；尤其是在低温时仍有相当高的溶解度 ②分离效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用，不易引起变性； ④价格便宜；废液可以肥田，不污染环境。 缺点： 硫酸铵水解后变酸，在高 pH 值下会释放出氨，腐蚀性 较强，因此，盐析后要将硫酸铵从产品中除去。 （ 3 ）影响盐析的因素 a. 蛋白质浓度 一般较适当的样品浓度是 2.5%-3.0% ，通过实 验确定。 b. 离子强度和类型 一般来说 , 离子强度越大 , 蛋白质溶解度越低。 下面为几种盐盐析能力排列次序 : 磷酸钾 硫 酸钠 磷酸铵 柠檬酸钠 硫酸镁 ③ [3] Gelazka V B ,Smith D D S ,Ledward D A ,et al .Influence of high pressure on protein-polysaccharide interactions[J] . Pros.Int.Conf ,1998,24:397-400. c.pH 值 一般来说 , 蛋白质所带净电荷越多 , 溶解度越大；净电荷 越少 , 溶解度越小 , 在等电点时蛋白质溶解度最小 , 为提高 盐析效率 , 多将溶液 pH 值调到目