PCR及其衍生技术解析.pptVIP

如何提高 PCR 中的 DNA 聚合酶的保真性？ ? 在 PCR 反应体系中，除使用 Taq DNA 聚合酶，掺入 少量的 具有 3 ′→ 5 ′ 外切酶活性的耐热 DNA 聚合酶，如 Pfu ， Vent ， Pwo 等 ，错配率可降为原来的 1/10 ； ? Mg 2+ 浓度 尽可能低，但不影响 DNA 合成； ? 减少高温反应时间，这样 DNA 热损伤将减少； ? 减少循环数。 ⑤引物 3 端的碱基要求严格配对（不能做任何 修饰） — 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致 PCR 失败 ⑥引物 5′ 端可修饰 — 引物 5′ 端限定着 PCR 产物的长度，但对扩增特 异性影响不大；引物 5′ 端碱基可不与模板 DNA 互补而呈游离状态；引物 5′ 端最多可加 10 个碱 基而对 PCR 反应无影响 3 5 5 3 启动子序列 定点突变 探针标记 限制性内切酶的识别序列 ⑦引物的特异性： — 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性 ⑧引物量： — 每条引物的浓度 0.1 ~ 0.5 μ M ，以最低引物量产 生所需要的结果为好 — 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且 可增加引物之间形成二聚体的机会 实例：设计人类 GAPDH 基因 mRNA 的引物 1. 用 Primer Premier 软件设计引物； 2. 在 UCSC Genome Browser 上验证（如果 失败则重新设计） 1. 我们设计的引物，是根据 GAPDH 的 mRNA 序列设计的，理论扩增长度是 318bp ，但它 却在人类基因组上扩增出了 两个片段 ； 2. 第一个片段来自 12 号染色体 的扩增，长度为 2409bp ；第二个片段来自 X 染色体 的扩增， 片段长度是 318bp 。 ? 那么，那个扩增片段才是正确的呢？我们设 计的这一对引物可否用于扩增人类 GAPDH 基因片段呢？ ? 12 号染色体扩增出的序列是真正的 GAPDH 基因。 ? 在下面的序列比对中，我们可以发现， X 染 色体上被扩增出的序列实际上是 GAPDH 的 加工的假基因 （ processed pseudogene ）。 ? 因此，如果我们能保证作为模板的 cDNA 不 混杂有染色体 DNA ，就可以用这一对引物 扩增 GAPDH 。 2 、酶及其浓度 ? 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 – 天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯 – 基因工程酶：大肠菌合成 ? 一个典型的 PCR 反应约需酶量 1- 2.5U/100 ul 体系 ? 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产 物量减少 Taq 酶的保真性不高 ? 5→3 聚合酶活性和 5→3 外切酶活性， 无 3→5 外切活性 ; ? 在 PCR 反应中如发生某些碱基的错配，该 酶是没有校正功能的。保真性不如 Pfu DNA 聚合酶 等。 3 、 dNTP 的质量与浓度 – 在 PCR 反应中， dNTP 应为 50 ～ 200 μ M ，浓度 过低会降低 PCR 产物的产量 – 注意 4 种 dNTP 的浓度要相等（等摩尔配制 ） , 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏 高或偏低），就会引起错配 – 高浓度的 dNTP 可与 Mg 2+ 结合，使游离的 Mg 2+ 浓度下降，影响 DNA 聚合酶的活性 4 、模板 DNA 模板 DNA 的来源： — 微生物中提取 DNA — 从细胞中提取 DNA ：血细胞、绒毛、尿样、毛 发、精斑、口腔上皮细胞 — 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶 K 消化 模板 DNA 的浓度： 0.1 ～ 2ug/100ul 体系 — PCR 产量随模板 DNA 浓度的增加而显著升高 — 模板 DNA 浓度过高导致非特异性产物增加 5 、 Mg 2+ 浓度 ? 2+ Mg 对 PCR 扩增的 特异性 和 产量 有显著 的影响 ? 在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 2+ 200umol/L 时， Mg 浓度为 1.5 ～ 2.0 mmol/L 为宜 ? Mg 2+ 浓度过高，反应特异性降低，出现 非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少 二、