病毒感染的试验诊断.ppt

病毒感染的实验诊断 王 跃 临床微免教研室 什么是病毒？ ? 病毒（ virus ）是一类体积微小、结构简单、 有严格的细胞内寄生性的非细胞型微生物。 ? 特点： ? 体积微小，只能在电镜下观察，能通过滤菌器 ? 无完整的细胞结构：蛋白质衣壳＋核酸核心 ? 只有一种类型核酸： RNA 或 DNA ? 有严格的细胞内寄生性，只能在活细胞内生长 ? 以核酸复制的方式增殖，不能进行二分裂繁殖 ? 抵抗力特殊：耐冷不耐热，对化学因素的抵抗力较 一般比细菌强，耐甘油，对抗生素及磺胺类药物不 敏感，干扰素可抑制病毒复制。 病毒感染的实验诊断方法 ? 病原学诊断 ? 病毒分离培养 ? 显微镜检查 ? 抗原检测 ? 核酸检测 ? 血清学诊断 ? 抗体检测 IgM 、 IgG 一、标本采集、运送和处理 （一）标本采集 ? 采集时间：尽早采集（越早越好） ? 标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类 型选择标本种类 ? 无菌采集标本：必要时用抗生素或抗真菌药处理 ? 抑制细菌生长 100U/ml 青霉素＋ 100μg/ml 链霉素 ? 抑制真菌生长 2.5 μ g /ml 二性霉素 B 或 40 μg/ml 制霉菌素 ? 血清学检查标本：双份血清 （二）标本的运送与保存 1. 低温送检 ? 4 ℃可保存数小时， - 70 ℃可长期保存 ? - 10 ～ - 20 ℃下病毒易灭活，不可用于保存病毒标 本 ? 对冷冻标本应避免反复冻融 2. 保湿送检 ? 50% 甘油盐水保存送检 ? 病毒转运培养基（ virus transport medium ， VTM ） 含 0.5% 明胶或牛血清白蛋白的 Hanks 液 3. 无菌送检 ? 抑制细菌生长 100U/ml 青霉素＋ 100μg/ml 链霉素 ? 抑制真菌生长 2.5 μ g /ml 二性霉素 B 或 40 μg/ml 制霉 菌素 二、病毒的形态学检查 1. 光学显微镜检查 ? 主要观察病变组织中的包涵体，某些大病毒也通 过光学显微镜观察。 ? 简便、快速，但敏感性低，有些病毒感染细胞后 不形成包涵体 狂犬病毒胞浆内包涵体 （内基小体） 巨细胞病毒胞核内包涵体 （猫头鹰眼） 2. 电镜及免疫电镜检查 直接检查标本中的病毒颗粒，快 速，可确诊。但敏感性低（＞ 10 6 /ml ） 免疫电镜敏感性高，但只能用于 已知病毒的检测） 乙型肝炎病毒电镜图 轮状病毒电镜图 三、病毒的分离与鉴定 动物接种 组织培养 标本采集 标本处理后接种 鸡胚接种 卵黄囊膜 尿囊液 羊膜腔液 绒毛尿囊膜 观察囊膜病变 血凝试验 血凝抑制试验 CPE EM 包涵体 空斑试验 红细胞吸附 中和试验 观察发病 抗原检测 抗体检测 病理检查 （一）病毒的分离 ? 组织培养 ? 鸡胚培养 ? 动物接种 1. 组织培养 ? 将人或动物离体的活组织或分散的活细胞在体外 人工控制的条件下使其生长繁殖的一种技术。 组织培养的类型 : （ 1 ）组织块培养 （ 2 ）器官培养 人胚气管－呼吸道病毒； 人胚肠－ 肠道病毒 （ 3 ）细胞培养 最常用 ? 原代和次代细胞培养 ? 二倍体细胞培养 ? 传代细胞培养 ? 动物新鲜组织（人胚肾等） → 胰酶消化 → 营养 液培养 → 单层细胞（原代细胞） ? 原代细胞 → 胰酶消化 → 转种培养（次代培养细 胞） ? 对病毒敏感，但制备费时费力，只能传 2 ～ 3 代。 原代和次代培养细胞 二倍体细胞株 原代细胞反复传代（ 50 ～ 70 代） 仍保持二倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制 备的首选细胞株。 传代细胞株 来源于肿瘤细胞或突变的二倍体 细胞，能在体外无限增殖。增殖快，不易衰老， 易于传代保存。常用于病毒的分离鉴定，但不 能用于制备疫苗。 优点 ? 细胞来源广、敏感细胞株多 ? 不受机体免疫因素的影响，个体差异小 ? 病变结果易于观察 ? 可用于病毒的分离鉴定和制备疫苗及抗原 缺点 ? 条件要求相对较高，有细胞培养条件的实验室 才能做 2. 鸡胚培养 新鲜受精卵 接种病毒