生化分离与纯化技术 凝胶色谱分离技术在生产中的应用 凝胶色谱分离技术——操作与应用.pptVIP

LOGO 凝胶色谱分离技术 ——操作与应用 凝胶色谱分离技术——操作与应用 凝胶过滤色谱法的操作方法 1 凝胶过滤色谱法的应用 2 （一）凝胶的选择 凝胶的选择依据： 1.分离范围；2.分辨率；3.稳定性。 如制备分离中的脱盐，大多采用硬胶，既容易操作，又可得到满意的流速，常用交联葡聚糖凝胶G-25、G-50。对于小肽和低分子量物质（1000-5000）的脱盐可采用交联葡聚糖凝胶G-10、G-15及生物凝胶P-2、P-4。 凝胶色谱分离技术——操作与应用 凝胶过滤色谱法的操作方法 （二）凝胶的预处理 1.葡聚糖和聚丙烯酰胺凝胶 以干品出售的，所以使用前必须溶胀。溶胀必须彻底，若溶涨不充分，则装柱后凝胶继续溶涨，造成填充层不均匀，影响分离效果，甚至有使柱破裂的危险。 溶胀方法：在烧杯中将干燥凝胶加水或缓冲液，搅拌、静置、倾去上层混悬液、除去过细的粒子。如此反复多次，直至上层澄清为止。 凝胶色谱分离技术——操作与应用 凝胶过滤色谱法的操作方法 （二）凝胶的预处理 2.琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶是以浓悬浮液的形式出售的，因此不须溶胀。琼脂糖凝胶的正常操作温度是0-30℃，高于36℃时，这种凝胶就要软化解体。 凝胶色谱分离技术——操作与应用 凝胶过滤色谱法的操作方法 （三）层析柱的选择 层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径。 分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关。 层析柱越长，分辨率越高。 凝胶色谱分离技术——操作与应用 凝胶过滤色谱法的操作方法 （三）层析柱的选择 从大分子（M.W.20 000）中分离小分子，如无机盐或代谢中间物（M.W.1 500）时，柱床体积应是上样体积的4-10倍，柱高：柱直径应为5:1-15:1。这类柱叫除盐柱。 分离大分子时，柱床体积应为上样体积的25-100倍，柱高：柱直径应为20:1-100:1。 直径小于1 cm的柱，在湿润的玻璃柱壁上有“壁效应”，能严重降低柱的分辨率。 凝胶色谱分离技术——操作与应用 凝胶过滤色谱法的操作方法 （四）凝胶柱的装填 1.空柱中应留1/5的水或溶剂。 2.所用凝胶必须是经过充分溶涨的。 3.开始进胶后应当打开柱端阀门并保持一定流速，太快的流速往往造成凝胶板结，对分离不利。 4.进胶过程必须连续、均匀，不要中断，并在不断搅拌下使胶均匀沉降。为此，层析柱要始终保持垂直。 5.凝胶悬液浓度也需控制，过稀和过浓都会产生不利影响。 凝胶色谱分离技术——操作与应用 凝胶过滤色谱法的操作方法 （五）样品处理和加样 分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4％（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30％。 分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。 加样时尽量减少样品的稀释及凝胶床面的搅动。 (1) 直接将样品加到层析床表面； (2) 利用两种液体相对密度不同而分层。 凝胶色谱分离技术——操作与应用 凝胶过滤色谱法的操作方法 （六）洗脱与收集 当样品液恰与凝胶床表面平时，加入数毫升洗脱剂冲洗管壁。既要使样品恰好全部渗入凝胶床，由不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。然后用大量洗脱剂洗脱。 为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及重复性下降，整个洗脱过程中始终保持一定的操作压，并不超限是很必要的。流速不宜太快且要稳定。洗脱液的成分也不应改变，以防凝胶颗粒的胀缩引起柱床体积变化或流速改变。 凝胶色谱分离技术——操作与应用 凝胶过滤色谱法的操作方法 （七）凝胶的再生和保养 因为凝胶本身不与溶质发生任何作用，所以一次分离后无须再生处理就可以进行下一次分离。一般的层析床可反复使用数十次。 交联葡聚糖凝胶柱可用0.2 mol/L NaOH和0.5 mol/L NaCl混合液处理，聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶由于遇酸、碱不稳定，常用0.5 mol/L NaCl处理。 凝胶色谱分离技术——操作与应用 凝胶过滤色谱法的操作方法 1.脱盐及去除小分子杂质和溶液的浓缩 2.分离生物大分子物质 3.去除热原物质 4.测定蛋白质的分子量 凝胶色谱分离技术——操作与应用 凝胶过滤色谱法的应用 部分版权来源于易庆平和太原科技大学温艳珍 LOGO 部分版权来源于易庆平和太原科技大学温艳珍