骨缺损的基因治疗初探.docxVIP

骨缺损的基因治疗初探 一基因治疗骨缺损的技术选择 基因治疗骨缺损的方法很多，需要根据研究目的不同，可选择不同的目的基因、不同的靶细胞、不同的基因载体以及不同的基因转移方法等。 1、目的基因的选择 基因治療首要的问题是选择用于治疗的目的基因。凡是能促进骨折愈合和骨生长的基因理论上均可作为基因治疗骨缺损的目的基因。主要包括骨形态发生蛋白、可溶性生长因子（如血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子）、影响合成代谢的因子（如甲状旁腺激素，甲状旁腺激素相关蛋白）、影响血管生成因子（如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子）、影响骨相关基因表达的因子、细胞外基质中的受体及受体拮抗因子（如白细胞介素I受体、骨形态发生蛋白受体）及矿化蛋白-I等。这些基因表达的产物多为细胞外分泌型因子，但也有例外，如矿化蛋白-I就属于细胞内因子。 骨形态发生蛋白是骨生长的启动因子，能诱导骨髓基质细胞分化为成骨细胞和骨细胞，促进钙化作用，产生钙化的骨基质。目前已有商品化的骨形态发生蛋白应用于临床。随着重组DNA技术的应用，已有十多种骨形态发生蛋白CDNA被成功克隆。骨形态发生蛋白基因是目前骨缺损基因治疗中应用最多的目的基因，已在兔、鼠、羊和狗模型中证实其对骨缺损的修复作用。而骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白又是骨形态发生蛋白家族中成骨作用最强的。 2、靶细胞的选择。 靶细胞选择是关系基因治疗成功与否的一个重要因素。理论上，任何细胞均具有接受外源基因的能力，但因为伦理及法律等因素，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞。用于基因治疗的靶细胞应具有以下一些条件：a.取材容易，含量丰富，在体外容易培养。b.外源基因能够高效导入并表达。c.细胞寿命长。 目前骨缺损基因治疗中应用的靶细胞有骨髓基质细胞、成纤维细胞、肌细胞等。应用最多的是骨髓基质细胞。 3、基因表达载体的选择有两种：病毒表达载体和非病毒表达载体。病毒表达载体种类很多，包括腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等。非病毒表达载体包括脂质体、基因枪、裸DNA。Hnnallah等Kang和Kang 等分别就两种载体在骨科基因治疗领域的应用做过总结。 目前研究中应用最多的是腺病毒，相对于质粒载体而言，腺病毒载体具有以下特点：滴度高；装载基因容量大；有较广的宿主范围；可转染分裂期和非分裂期的细胞。但作为病毒类载体的一种，病毒壳体蛋白在靶细胞表面表达后具有较强的免疫性，可致机体产生急性免疫反应。此反应成为腺病毒载体在非致死性疾病基因治疗方面的最大障碍。 二基因治疗骨缺损研究进展 1、基因治疗与组织工程结合治疗骨缺损。 组织工程化骨包括3要素：种子细胞、信号因子（细胞因子或生长因子）及可吸收生物支架材料。其中信号因子的适时、适量释放是现行组织工程骨研究的热点和难点。利用基因工程技术与组织工程技术相结合的办法，将基因治疗中携带目的基因的靶细胞作为组织工程骨的种子细胞，与支架材料复合构建而成的人工骨称为基因强化组织工程骨。利用该技术治疗骨缺损既保留了基因治疗和组织工程骨单独治疗骨缺损时的优点，又克服了单独使用时的不足，可能是未来治疗复杂性骨缺损的方向。金丹等用人骨形态发生蛋白7基因转染兔骨基质细胞，后与左旋聚丙交酯复合培养，组建基因强化的组织工程骨，修复兔桡骨中段1.5cm 缺损。术后3周时人骨形态发生蛋白7转染骨髓基质细胞+左旋聚丙交酯组和未转染骨髓基质细胞+左旋聚丙交酯组骨缺损两端和缺损中心有密度增高影，提示有新骨生成，6周时新骨量增多，相比较而言，转染组形成的新骨与正常兔桡骨相似，未转染组形成的骨桥较薄，体积明显小于前者；单独左旋聚丙交酯组和对照组缺损两端只有少量骨组织形成，大部分仍被纤维结缔组织充填，骨缺损未修复。 2、多基因联合治疗骨缺损。 目前骨缺损的基因治疗研究多集中在单一目的基因方面。事实上，在骨折愈合及骨生成过程中，有多个基因共同参与，并协同表达。测定细胞培养上清液中碱性磷酸酶的活性，结果发现，骨形态发生蛋白* 腺病毒表达载体，骨形态发生蛋白， 腺病毒表达载体分别与骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体联合时，细胞上清液中碱性磷酸酶的活性均较单基因应用时高2--4倍，提示联合应用时成骨能力提高，而骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体与骨形态发生蛋白， 腺病毒表达载体联合时，与骨形态发生蛋白* 腺病毒表达载体单独应用无差别。 三 问题与展望 创伤、肿瘤及人工关节翻修手术等均可造成骨缺损。传统的治疗方法包括自体骨移植、异体骨移植和人工骨等，这些方法均有一定的局限性，难以完全满足临床需要。基因治疗非致死性、非遗传性疾病的研究始于二十世纪八十年代。与其他慢性病或遗传病不同的是，骨缺损基因