bihemistry reprt 生化实验报告.docVIP

PAGE PAGE 7 生物化学综合型教学实验 1 目的与要求 1.1 酵母蔗糖酶的提取和酶蛋白浓度的测定 学习酶的纯化方法，掌握酶蛋白分离提纯的原理。 1.2蔗糖酶活性测定 掌握用3,5-二硝基水扬酸测定还原糖的方法 1.3底物浓度对酶活性的影响 了解酶活性和底物浓度之间的关系 进一步掌握3,5-二硝基水扬酸测定还原糖的方法 1.4温度对酶活性的影响 理解温度和酶活性之间的关系 1.5蔗糖酶促反应与时间的关系 知道酶反应时间与酶产物多少有关 1.6酵母细胞固定化 掌握酵母固定化酶技术 2 材料与方法 2.1酵母蔗糖酶的提取和酶蛋白浓度的测定 2.1.1材料 2.1.1.1 试剂 新鲜酵母、考马斯亮蓝G-250试剂、标准蛋白质溶液、石英砂 2.1.1.2 器材 研钵、离心机、可见光分光光度计、刻度吸管、试管、量筒、离心管等 2.1.1方法 酵母蔗糖酶粗酶液的提取 称取冰冻鲜酵母10g、石英砂5g于研钵中，研磨30min，加入蒸馏水10ml,3500r/min离心15min,弃沉淀及脂层，取中间清液层，再在10000r/min离心5min，取上清液，量取体积，冰箱保存、备用。 酶蛋白浓度测定 标准曲线绘制 取6支试管，按表2.1.1加入各试剂 表2.1.1 管号 试剂 0 1 2 3 4 5 100μg/ml牛血清蛋白/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝液/mL 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min，在595nm波长下比色测定，记录A595。以各管相应蛋白质含量（μg）为横坐标，A595纵坐标绘制标准曲线。 （2）样品测定 试管中加样品（稀释酶液）1.0ml，再加入5.0ml加入考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，测定并记录A595。 根据所测A595从标准曲线上查的蛋白质含量。并计算酵母蔗糖酶粗酶液的蛋白质浓度。 2.2蔗糖酶活性测定 2.2.1 材料 2.2.1.1试剂 3，5-二硝基水杨酸试剂、500ug/l葡萄糖溶液、蔗糖酶粗酶液、0.1mol/l乙酸钠缓冲液（PH4.5）、0.1mol/l蔗糖液、用0.1mol/l乙酸钠缓冲液（PH4.5）配制1mol/l NaOH 2.2.1.2 试管、刻度吸管、恒温水浴、沸水浴、可见光分光光度计等 2.2.2 1.制作标准曲线 取9支试管编号，编号0-8，分别加入500ug/ml 葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0。7、0.8ml于试管，用蒸馏水补足到1.0ml，在加0.5ml3，5-二硝基水杨酸试剂呼吁各管中，每加一管立即混匀，各试管置沸水浴加热5min后用流水冷却，每管再加4.0ml蒸馏水，摇匀后以0号管为对照，于540nm波长处比色并读取各管的光吸收值。以葡萄糖含量为横坐标，相应的A540为纵坐标作标准曲线。 2.样液测定 取两支试管各加入0.1mol/l蔗糖液1.0ml。试管一中加入1mol/lNaOH 0.25ml，再加稀释酶液1ml；而试管二中加稀释酶液1ml，35C准备反应5min后，再加入1mol/lNaOH 0.25ml，立即混匀，终止反应。 另取两支试管，一为空白管，另一为测定管。空白管吸取上述试管一中样液1.0ml，测定管吸取上述试管二中的样液1.0ml，两支试管中分别再加入3，5-二硝基水扬酸0.5ml，混匀置沸水域中加热5min,然后流水冷却，每管再加4.0ml水，摇匀后以空白管为对照，于540nm波长处比色并读取测定管的光吸收值。根据其A540值，在标准曲线上求得相应的还原糖含量。 2.3底物浓度对酶活性的影响 2.3.1材料 2.3.1.1试剂 蔗糖酶粗酶液、0.1mol/l蔗糖液　用0.1mol/l乙酸钠缓冲液（PH4.5）配制、3，5-二硝基水杨酸试剂、1mol/l NaOH 2.3.1.2器材 恒温水浴槽、可见光分光光度计、试管、刻度吸管 2.3.2方法 取10支试管一0~9编号，1~9管按下表顺序分别加入各试剂，精确反应5min后终止反应。0号管加入试剂与其它管相同，则是先加NaOH，然后加稀释酶液。 表2.3.2 编号 试剂 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.1mol/l/蔗糖液/ml 0 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 0.6 0.8 1.0 1.2 0.1mol/l乙酸钠缓冲液(PH4.5)/ml 2.0 1.8 1.75 1.7 1.6 1.5 1.4 1.2 1.0 0.8 稀释酶液 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 35C反