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玉米遗传转化体系的优化及 HrpZ 基因转化玉米的研究 HrpZ 基因是一种来源于植物病原菌丁香假单胞菌 (Pseudomonas syringae) 的蛋白激发因子 , 它能引起非寄主植物的过敏性反应 (hypersensitive response, HR), 表现为受侵染组织的快速、局部的萎缩和死亡 , 这就限制了病原菌进一步扩 散的可能性。 HR反应后 , 植物体内出现了一系列的防反应 , 如强化结构屏障作用 , 合成裂解酶或者产生植物抗毒素 , 具体表现在能够防止病菌二次或继发性侵染。 这种非局部化、长期的诱导保护作其抗菌谱很广 , 极类似于“系统获得性抗 性” (systematic acquired resistnace SAR) 。玉米 (Zea may L.) 是世界上重要 的粮食、饲料作物 , 也是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料。 产量居农作物之首 , 也是重要的遗传模式植物。 长期以来 , 玉米优良基因型高 效再生体系的建立一直是人们研究的热点。 我国是世界上仅次于美国的第二大玉米生产国 , 玉米生产在国民经济中占有 非常重要的地位。然而 , 生产上玉米病害一直是影响玉米产量的重要限制因素 , 传统的常规育种由于抗源的缺乏和不同物种间的遗传隔离 , 使抗病育种工作受到 了极大的限制。 利用基因工程技术进行玉米遗传改良 , 增强玉米抗病虫和耐逆境能力 , 提高 产量 , 改善品质 , 是玉米遗传育种的一个新方向。因此 , 玉米的基础研究和遗传改 良具有重大的理论和现实意义。 为进一步筛选和建立优良玉米自交系的再生和遗传转化体系 , 本文分别以玉 米幼胚 , 成熟胚 , 茎尖 , 根尖及幼叶为外植体进行愈伤诱导 , 较系统地研究了常规 优良自交系的愈伤组织形成及分化再生的影响因素、农杆菌介导遗传转化体系 , 并对转化株进行了 PCR检测 , 获得了如下主要结果： 1. 选用了生产上广泛应用的 10 个玉米优良自交系 , 通过组织培养研究其愈伤诱导及植株再生情况 , 并优化了 玉米愈伤诱导及再生的条件 , 为开展转基因育种提供了技术基础。 结果表明 , 玉米 自交系基因型间的培养能力具有较大的差异 ,10 个玉米自交系幼胚都能诱导出 初级愈伤组织 , 但是形成胚性愈伤组织的能力上具有很大的差异 , 其中仅 6 个自 交系： H99,丹 988, 铁 7922,1322,7319 和 PH4CV能形成胚性愈伤组织；以实验室 多年来筛选的优良自交系 H99,丹 988 和铁 7922 的幼胚 , 成熟胚 , 茎尖 , 根尖及幼 叶为外植体诱导愈伤 , 实验证明 , 根尖和幼叶只能诱导出初级愈伤。 三个基因型中仅丹 988 的幼胚 , 成熟胚 , 茎尖能够诱导出胚性愈伤组织 , 可见 988 为愈伤诱导的优良自交系。 此外 , 适当浓度的 6-BA 仅能提高茎尖的愈伤诱导率 , 培养基种类 , 胚龄 ,4 ℃冷存时间 , 不同附加物 KT,CaCl2, AgNO3 的添加对幼胚来源的愈伤也有一定的影响。 采用正交试验法 , 选用丹 988 的茎尖来源幼胚为受体材料 , 以 pCAMBIA1301-HrpZpsta和 PCAMBIA3301-HrpZpsta为表达载体 , 对农杆菌转化中 的菌液 OD值、侵染时间、共培养时间和 AS浓度四因素进行了优化。 确定了农杆 菌介导的转化体系的最优条件为菌液 OD值 0.6 、浸染时间 20mi n 、共培养时间 2d 和 AS浓度 300μmol/L 。 此外 , 鉴定了 H99和月 988 的玉米愈伤组织耐盐碱敏感性和抗草胺磷敏感性 , 确定玉米愈伤组织盐和草胺磷临界浓度；茎尖来源的愈伤组织的抗性愈伤率 , 再 生率及转化率均略高于幼胚 , 显著高于成熟胚。将含有 HrpZ 基因的重组质粒经农 杆菌介导法转化玉米愈伤 , 经 PCR检测共获得 H99 抗盐植株 18 株, 抗草胺磷植株 10 株, 丹 988 抗盐植株 12 株, 抗草胺磷植株 5 株。 但并未收获 T1 代果实。 3. 对花粉管通道法的外源 DNA导入时期和浓度进行 了探讨 , 仅获得丹 988 的两棵转基因植株。 花粉管通道法虽然转化效率比较低 , 但可避开组织培养继代繁琐、再生植株 移栽成活较难等障碍 , 仍不失为一种良好的方法。