新型脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解菌的筛选及其降解机制研究.pdfVIP

摘要 摘要 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 （Deoxynivalenol, DON ），又称呕吐毒素，是由多种镰 刀菌产生的一种倍半萜类次生代谢产物，属于B 型单端孢霉烯族毒素。DON 毒 性大、难降解，是当前小麦等谷物中危害最严重的真菌毒素之一，因此亟需开发 高效的脱毒方法以解决粮食和饲料中的DON 污染问题。与传统的物理、化学等 脱毒方法相比，生物脱毒法具有成本低、效率高、环境友好等优势，是最具前景 的DON 脱毒方法。目前针对DON 生物降解的研究仍然存在降解菌株匮乏、降 解机制不明晰等瓶颈。鉴于此，本论文筛选了可高效稳定降解DON 的天然菌群 株系，鉴定了菌群的核心功能菌株，解析了DON 的降解途径和降解机制，挖掘 并获得了潜在的DON 降解元件，实现了DON 的高效生物降解，主要结果分述 如下： （1）筛选获得了可稳定降解DON 的天然菌群株系，鉴定了菌群C13 的核 心功能菌株为 Devosia sp. A8 和 Paracoccus yeei A9 ，DON 降解产物为 3-keto-DON 。 从作物长期受镰刀菌污染的地区采集到176 个样品，富集筛选获得4 组能稳 定降解DON 的微生物菌群。基于高通量测序和微生物群落结构分析，推测细菌 Devosia spp.和Sphingomonas spp.是潜在的DON 降解菌株。通过对DON 降解菌 群 C13 中的菌株进行分离纯化并未获得单一的降解菌株，进一步设计了人工组 合实验，最终获得一个由两株菌（A8 和A9 ）组成的双菌体系，对DON 具有高 效稳定的降解功能。 通过形态学观察、生理生化特性分析及16S rRNA 基因序列分析，发现菌株 A8 和A9 分别与Devosia sp.和Paracoccus yeei 同源性较高。通过对Devosia sp. A8 与P. yeei A9 的生长特性研究发现，Devosia sp. A8 和P. yeei A9 对大多数抗生素 都较为敏感。Devosia sp. A8 最适宜生长在0.5% NaCl 的0238 培养基上（pH 8.0 ）， 且最适培养温度为30 °C；而P. yeei A9 则最适宜在0.2% NaCl 的SOC 培养基上 （pH 7.0-8.0 ）生长，最适培养温度为 35 °C 。进一步优化双菌降解体系发现， Devosia sp. A8 和P. yeei A9 降解DON 的最佳初始比例为8:2 ，最适温度为35 °C， 最适pH 为8.0-9.0，最适接种量为0.5% 。通过HPLC 分离、LC-MS/MS 和NMR 鉴定,发现双菌体系降解 DON 的产物为 3-keto-DON 。此外，该双菌体系对 3-ADON 、15-ADON 和T-2 毒素均有一定的降解效果。以上结果为后期DON 降 解机制的解析提供了理论基础，也为DON 降解菌的筛选提供了新的方法和思路。 I 摘要 （2 ）解析了双菌体系中菌株间的互作机制，推测P. yeei A9 通过提供电子 介体协同Devosia sp. A8 降解DON，初步鉴定了降解活性物质的生物学特性。 为了分析菌株Devosia sp. A8 和P. yeei A9 在DON 降解中的作用，分别考察 了外源添加辅因子（NADPH 和NADH ）及电子介体（核黄素）对菌株降解DON 效率的影响。结果显示，当NADPH 或核黄素存在时，Devosia sp. A8 对DON 的 降解效率有所提高；而无论是否添加辅因子和电子介体，P. yeei A9 都没有DON 降解能力，推测在双菌体系降解过程中Devosia sp. A8 起主要作用，而P. yeei A9 则主要为降解过程提供电子介体。进一步对双菌体系中活性物质的理化性质进行 分析发现，Devosia sp. A8 中降解DON 的活性物质为带负电荷、分子量 100 KDa 的胞内蛋白或蛋白聚合体，P. yeei A9 中辅助Devosia sp. A8 降解DON 的活性物 质为耐高温、分子量 3 KDa 的胞内活性肽。以上结果为后期活性物质的分离纯 化奠定了基础。