生物制品分析概论.pptVIP

2021/2/11 * 比色法 利用样品与显色剂发生现色反应,根据反应产物的颜色强度来测定含量。Elson-Morgan 硫酸软骨素的比色法测定:在酸性条件下使样品水解成氨基己糖,再在碱性条件下与乙酰丙酮和二甲氨基苯甲醛反应生成红色的产物,该产物在525 nm处有最大吸收。 光谱分析方法 2021/2/11 * 具体试验操作: 1、制备对照品溶液－氨基葡萄糖 2、制备供试品溶液－硫酸软骨素 3、反应和测定－缩合反应和比色测定 A平为供试品溶液的吸收度 As平为对照品溶液的吸收度 Ws为对照品溶液的浓度（mg/ml） W为称样量（mg） 0.8309为校正因子 500为稀释倍数 以氨基葡萄糖计≥24.0％ 2021/2/11 * 色谱法 1）RP-HPLC:反相高效液相色谱法 色谱柱柱:C8,18烷基硅烷键合相;  流动相:甲醇（或乙腈）－水（或缓冲液） 梯度洗脱  检测器:紫外、荧光检测器;电化学检测器 应用:肽类、氨基酸、蛋白质、多糖的定量分析 2021/2/11 * 2）HPIEC:高效离子交换色谱（high performance ion exchange chromatography ） 应用:蛋白质,多肽的分离测定 色谱柱:离子交换键合相 流动相:0.3mol/L～1.0mol/L的盐的缓冲液。 梯度洗脱:盐的浓度逐渐增大。尽量避免使用卤素类盐 特点:可回收活性蛋白。 2021/2/11 * 3）HPGFC:高效凝胶过滤色谱法（high performance gel filtration chromatography ） 原理:分子筛效应（根据分子大小分离） 应用:蛋白质、多肽的分离及分子量测定。 色谱柱:凝胶色谱柱 流动相:水或缓冲液（常加入有机改性剂） 特点:活性蛋白可回收 2021/2/11 * 4）灌注色谱法（perfusion chromatography ） 定义:使用具有“贯通孔”的填料使流动相快速地贯穿填料颗粒流动,从而加快填料内传质过程的液相色谱方法。 固定相:聚苯乙烯二乙烯高度交联结构上构 成的贯穿孔颗粒(POROS); 颗粒分离介质POROSR。 双模式孔结构:80～150nm大扩散孔 600～800nm贯穿孔 2021/2/11 * 允许液体传送流经过分离介质内表面,使样品由流动相直接灌注入介质颗粒中,扩散作用不再是主要的。 介质颗粒内部可利用反应的表面积增加,容量和分辨率也随之增加,可使生物活性大分子快速分离纯化。 应用:基因工程药物和其他大分子药物的分离纯化和分析。 2021/2/11 * 酶法 1、酶活力法:以酶作为分析对象; 2、酶分析法:以酶为分析工具或分析试剂; 2021/2/11 * 酶活力测定法 1）基本原理: 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。  2021/2/11 * 活力单位（国际单位,IU） 在25℃,以最适当的底物浓度、最适当的缓冲液离子强度以及最适当的pH等条件下,每分钟能转化1μmol底物的酶量。 比活性（IU/mg蛋白质） 每1mg蛋白质所含的酶单位数。 2021/2/11 * 酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。 通常酶活力测定时,先制备酶反应进程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速度的测定,求得酶的浓度或含量。 2021/2/11 * 酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量,横坐标为反应时间,曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。酶浓度曲线 纵坐标为反应速度,横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。  2021/2/11 *  2021/2/11 * 酶活力测定的要求:测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系,这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。 2021/2/11 * 2）酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度:一般选用底物的浓度[S]=100Km pH:选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、 适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。 温度:酶反应的温度通常选用25℃、30℃或 37℃,实验中温度变动应控制在±0.1℃以内 辅助因子:有些酶需要金属离子,有些