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基因克隆技术在葡萄研究中的应用 (西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌712100) 摘要：本文从克隆工具及相关方案研究、基因克隆用于序列分析、葡萄生产相关基因的克隆与 表达、用葡萄基因构建其它转基因生物、转基因技术面临的挑战与解决方案综述了基因克隆技术在葡萄研 究中的应用，并并对相关问题进行了讨论和展望。 关键词：基因克隆：葡萄：应用 The application of gene cloning in study of grape SONG Chang-zheng (College of Enology, Northwest A F University, Yangling, Shaanxi 7/2100, China) Abstract： we summarized the application of gene cloning in study of grape from the following points: tools of gene cloning and the optimizing of the study, the use of gene cloning in sequence analysis, cloning and expressing of the relevance genes in grape production, structure of other organisms with genes from grape, challenge of transgenosis and solution. Furthermore we discussed related issues and had a look into the distance? Key words: gene cloning; grape; application VI n 葡萄是世界主栽果树之一，产量仅次于柑桔位居第二c世界年生产葡萄的80%用来酿洒, 16%鲫食，4%制T （王华和张继潮.2003） 0多年來齐葡萄生产国政府和科研工作者均十分 重视葡萄的生产和科研工作。 基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术屮最核心的内 容，它是随看20世纪70年代初DNA体外囊纽技术的发明而发展起來的，其IT标是识别和分离 特异基因并获得基因完幣序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工 程手段应用到生产实践（陈儒钢，巩振辉等.2009） 0 日前基因克隆技术包括功能克隆，定位克隆，转座子标签法，抑制性差减杂交，同源序 列法，基因芯片，电子克隆等（陈儒钢，巩振解等.2009）,每种克隆技术都有特有的功能川 途。随着生物技术的飞速发展，人们越来越多地把目光投向具有商业价值的转基因植物。葡 萄遗传屮已有许多可以利用的目的基因，越来越多的1=1的基因已被克隆测序分析，或者导入 葡萄屮。同吋，葡萄基因组屮的一?些基因也被作为目的基因转入其它生物（如酿酒酵母及其 他作物）中。 克隆工具及相关方案研究 在常规的基因克隆过程屮常见工具包括引入外源DNA的工具，稳定转基因DNA的工具，选 择标记,以及合适的启动子、终止子等（Schuller and Casal. 2005） o 引入DNA的工具即载体，目前己经有一?系列构建的穿梭载体用于促进日的基因在工程酵 母屮的表达。被引入的载体必须具有在转化菌株屮自我复制的能力并能传递给芾代。n的基 因在重组菌株屮可以通过载体的自我复制或者与宿主基因组整合而得到稳定（Schuller and Casal 2005; Fang, Salmon et al. 2011）。 通常是通过标记基因编码可以催化解毒的活性酶，或者是止菌株发生对抗生索不敬感的 突变，从而达到筛选重组菌株的功能。在将衙萄中的目的基因克隆转化到酿酒酵母的研究也 有很多，在构建工程酵母过程屮的标记基因，包括隐性，半显性，显性标记(Cebollem, Gonzalez-Ramos et al. 2007)。隐性基因如URA3或者LEU2最为普遍。然而，因为酿酒酵母 菌株通常都是原养型的，这些标记基因都不能被使用。相比之下，显性或者半显性选择标记 的优点在于可以应用于任何菌株。例如，环己酰亚胺抗性基因，一个编码突变体核糖体蛋白 L29的半显性标记(PQrez-Gonzdlez, Gonzalez et al. 1993)；使用更多的还有用于丁?业酿 酒酵母转基因的G418抗性基因(Wach, Brachat et al. 1994)。 在植物转基因过程屮，通常两种标记基因也耍引入：允许进行细胞筛选的选择基因和对 供观察转基因发生的报告基因。较多使用的选择基因有新霉素磷酸转移酶基W(nptll),对 应抵抗卡那霉索；