饲料中莱克多巴胺的测定.docVIP

db33t539-2019饲料中莱克多巴胺的测定 本标准是在参阅了国内外文献的基础上，根据我国技术发展水平研究制定的，采用了酶联免疫法、高效液相色谱－荧光检测法和气相色谱-质谱法。 本标准由浙江省农业厅提出并归口。 本标准由浙江省畜产品质量安全检测中心、浙江省疾病预防控制中心负责起草，浙江一星集团饲料有限责任公司参与起草。 本标准主要起草人：陈慧华、吴平谷、应永飞、任玉琴、屈健、周文海、陈勇、浦琴华。 饲料中莱克多巴胺的测定 范围 本标准规定了以酶联免疫〔ELISA〕法、高效液相色谱〔HPLC〕法和气相色谱－质谱〔GC－MS〕法检测饲料中莱克多巴胺的方法，规定GC－MS法为仲裁法。 本标准适用于饲料和饲料添加剂中莱克多巴胺的测定。 酶联免疫〔ELISA〕法为筛选方法，检测限为0.01mg/kg，高效液相色谱〔HPLC〕法和气相色谱－质谱〔GC－MS〕法为定量方法，定量限HPLC法为0.1mg/kg、GC－MS法为0.05mg/kg。线性范围：酶联免疫〔ELISA〕法为0.005ng-0.05ng，高效液相色谱〔HPLC〕法为2.5ng-10ng，气相色谱－质谱〔GC－MS〕法为0.05ng-1.0ng。 规范性引用文件 以下文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单〔不包括勘误的内容〕或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样方法 试样制备 按GB/T14699.1抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取约200g，粉碎至过0.45mm孔径的分析筛，混匀，装入磨口瓶中备用。 第一法酶联免疫法 原理与方法 原理 本测定方法是酶联免疫法中的竞争性测定法，其主要原理是：吸附在孔内的莱克多巴胺与标准或样品中的莱克多巴胺竞争性地与莱克多巴胺抗体相结合，与标准品或样品相结合的莱克多巴胺抗体被洗涤去除后，只剩下与微孔内药物相结合的抗体，其再与加入的酶标记的第二抗体相结合，酶底物在酶作用下产生蓝色产物，吸光度的高低与样品中莱克多巴胺的含量成反比。 方法 采用莱克多巴胺酶联免疫试剂盒或类似产品，按试剂盒的使用说明操作。 试剂和溶液 除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GB/T6682二级水的规定。 PBS缓冲液：用水10倍稀释厂商提供的浓缩PBS缓冲液。 工作洗液：用水20倍稀释厂商提供的浓缩洗液。 乙酸乙酯。 碳酸盐缓冲液：称取4.3g碳酸钠〔Na2CO3?10H2O〕，2.9g碳酸氢钠〔NaHCO3〕，加水至1000mL，摇匀，调节pH值至9.5。 提取液：取10mL甲醇，加90mLPBS缓冲液，摇匀。 甲醇。 第二抗体工作液：用第二抗体稀释液2500倍稀释第二抗体。 仪器与设备 微孔板酶标仪(带450nm滤光片)。 振荡器。 冷冻离心机。 微量加样器及配套吸头：20μL,50μL,100μL,200μL。 冰箱。 洗板机。 生化培养箱。 氮吹仪。 分析天平：感量0.01g。 测定步骤 考前须知 不同品牌的试剂盒其操作步骤可能略有差别，具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整。 试样处理 取3g试样于50mL离心管中，加入6mL提取液〔5.5〕，上下手摇数次，加入6mL碳酸盐缓冲液〔5.4〕，再加入8mL乙酸乙酯〔5.3〕，振荡30min；以4000rpm的转速离心5min，移取2.0mL上层有机相至另一新试管中，氮吹至干。加入50μL甲醇〔5.6〕溶解残余物后，再加入450μLPBS缓冲液〔5.1〕，即为供试溶液，取50μL进行ELISA测定。 测试程序 根据所测定样品及标准数，计算出所需微孔条数，将微孔条插入微孔架，标准和样品做两个孔的平行重复，记录标准和样品的位置。 加入50μL的标准品和处理好的样品到各自的微孔中，标准和样品做两个平行重复。 加入100μL第一抗体溶液到每一个微孔中，在37℃孵育30分钟后倒出孔中的液体，将微孔架倒置在洗水纸上拍打〔每轮拍打3次〕以保证完全除去孔中的液体，再加入工作洗液〔5.2〕250μL，重复操作两遍。最后用吸水纸吸干。 加入150μL稀释的酶标记的第二抗体〔5.7〕37℃孵育30分钟后倒出孔中的液体，将微孔架倒置在洗水纸上拍打〔每轮拍打3次〕以保证完全除去孔中的液体，再加入工作洗液〔5.2〕250μL，重复操作两遍。最后用吸水纸吸干。 加入100μL酶底物液到微孔中，充分混合并在室温孵育5-10min。 加入50μL反应终止液到微孔中，混合后在450nm处测量吸光度值。 结果计算 以空白〔浓度为0的标准溶液〕吸光度值为100%计算，折算出各标准和样品的相对吸