基因编辑技术.docxVIP

基 因 编 辑 技 术 一、概念 基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术， 可 完成基因定点 InDel 突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等， 可在基 因组水平上进行精确的基因编辑。 二、应用 在科研领域，该技术可以快速构建模式动物， 节约大量科研时间和经费； 在农业领域， 该技术可以人为改造基因序列， 使之符合人们的要求， 如改良水稻等粮食作物； 在医疗领域，基因编辑技术可以更加准确、 深入地了解疾病发病机理和探究基因功能，可以改造人的基因，达到基因治疗的目的等。 三、作用机理 基因编辑技术本质上均是利用 非同源末端链接途径（ NHEJ）修复和同源重组（HR）修复，联合特异性 DNA的靶向识别 及核酸内切酶完成的 DNA序列改变。 注： 非同源末端连接 （Non-homologous End Joining-NHEJ) 是真核生物 细胞在不依赖 DNA同源性的情况下，而为了避免 DNA或染色体断裂（Breaks) 的滞留，避免因此造成的 DNA降解或对生命力的影响， 强行将两个 DNA断端彼此连接在一起的一种特殊的 DNA双链断裂修复机制。 同源重组（HR）修复即双链 DNA中的一条链发生损伤，在 DNA进行复制时，由于该损伤部位不能成为模板， 不能合成互补的 DNA链，所以产生缺口， 而从 原来 DNA的对应部位切出相应的部分将缺口填满，从而产生完整无损的子代 DNA的这种修复现象。 四、类别 ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9是三大基因编辑技术，这三种编辑工具的共同 点是：含有靶点 DNA序列的识别区域及 DNA剪切功能区域。 ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点 DNA TALEN的 DNA识别区域是重复可变双残基的重复， DNA剪切区域都是一种名为 Fokl 的核酸内切酶结构域 CRISPR的 DNA识别区域是 crRNA或向导 RNA， Cas9蛋白负责 DNA的剪 切 四、传统技术的优缺点 ZFN 的基因打靶效率能够达到 30%左右，已经可以做到针对某些特定的序列来设计 ZFN 实现靶基因的修饰，但也有其发展的局限性， ZFN 的 识别结构域中存在上下文依赖效应，使得ZFN设计和筛选效率大大降 低，所以目前尚无法实现对任意一段序列均可设计出满足要求的 ZFN， 也无法实现在每一个基因或其他功能性染色体区段都能够顺利找到适 合的 ZFN 作用位点，并且在已经成功运用的 ZFN的报道中，大多数 研究者并不公布其 ZF 序列。所以，在 ZFN的筛选和设计方面还存 在较大技术困难。另外，由于 ZFN的脱靶切割会导致细胞毒性，使得 其在基因治疗领域的应用出现了一定的局限性。 2. 相比  ZFN技术，TALEN  使用了  TALE  分子代替  ZF  作为人工核酸 酶的识别结构域，极好地解决了  ZF  对于  DNA  序列识别特异性低 的问题。 TALE蛋白与 DNA 碱基是一一对应的，并且对碱基的识别只 由 2 个氨基酸残基决定，这相对于 ZFN 的设计要简单得多。但是在构建过程中， TALE 分子的模块组装和筛选过程比较繁杂，需要大量的测序工作，对于普通实验室的可操作性较低，而商业化公司构建也需要花费上千美元，使用成本较高； 3）相较于 ZFn 和 TALEN 两种人工核酸酶技术， CRISPR/Cas9 系 统是一个天然存在的原核生物RNA干扰系统，其介导的基因组编辑是 由 crRNA 指导的，对靶序列的识别是 RNA 与 DNA 的碱基配对过程，相比蛋白质对 DNA 序列的识别要精确更多，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性。而且 CRISPR/Cas9 的构建仅仅需要设计与靶序列互补的 RNA 即可，过程相对于 TALEN 更为简单和廉价， 普通的实验室也可以自行完成构建， 这大大提高了基因操作的效率及简便性。但是， CRISPR/Cas9 系统也存在着一些不足。首先， Cas9 蛋 白对于目标序列的切割不仅仅依靠 crRNA 序列的匹配，在目标序列 附近必须存在一些小的前间区序列邻近基序 (PAM)，如果目标序列周围不存在 PAM或者无法严格配对，则 Cas9 蛋白不能对任意序列进行切割。最后，和 ZFN 及 TALEN 技术一样， CRISPR/Cas9 也面临着如何控制双链断裂之后的非同源末端连接修复可能随机产生细胞毒性的问题。 四、技术的新发展 2014 年 10 月 29 日 ， Nature 杂 志 上 发 布 了 名 为”  Promoterless  gene  targeting  without nucleases ameliorates haemophilia B in mice”的研究论文，据 悉