酵母核糖核酸的分离及组分鉴定1.ppt

酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 目的与要求 1. 了解稀碱法提取 RNA 的原理、方法 2. 掌握核酸中三大组分的鉴定方法 原 理 ? 核糖核酸 RNA ：从细胞核和细胞质中分离出来的 化学物质。 在蛋白质合成和其他生化反应中起着重要作 用， RNA 的结构和 DNA 的结构类似，都是由核苷酸 按照一定顺序排列成的长链。 RNA 可以分为信使 RNA 、转运 RNA 、核糖体 RNA 以及其他类型的 RNA 。 磷酸 碱基 戊糖 酵母菌单细胞真菌 酵母中主要成分是 RNA （ 2.67 ～ 10.0%) ， DNA 很少 (0.03 ～ 0.516%) 。 总 RNA 的提取 : 采用稀碱裂解法，乙醇沉淀 RNA, 洗涤除 杂质； RNA 组分鉴定 : 硫酸可使 RNA 水解，再分别鉴定 1. 核糖的鉴定——苔黑酚 (3,5 —二羟基甲苯 ) 法 CHO C H C H C H CH 2 OH OH OH OH O CHO OH O H CH 3 C O CH 3 O C H 3 OH -H 2 O 浓酸 核糖 3，5-二羟甲苯 糠醛 绿色化合物 墨绿色 2. 碱基的鉴定——嘌呤碱 嘌呤碱 + 过量浓氨水 +AgNO 3 絮状嘌呤银化合物 3. 磷酸的测定——定磷法 (NH 4 ) 2 MoO 4 +H 2 SO 4 H 2 MoO 4 +(NH 4 ) 2 SO 4 H 3 PO 4 +12H 2 MoO 4 H 3 P(Mo 3 O 10 ) 4 +12H 2 O+12H 2 O H 3 P(Mo 3 O 10 ) 4 Mo 2 O 3 MoO 3 ( 钼蓝） 试剂和器材 试 剂： 0.04M NaOH ；酸性乙醇溶液 , 95% 乙醇 1.5M 硫酸； 浓氨水， 0.1M 硝酸银； 三氯化铁浓盐溶液 , 苔黑酚乙醇； 定磷试剂 器 材 研钵，天平； 沸水浴， 低速台式离心机。 材 料 干酵母 一 . 提取步骤改动 ： 1. 5g 酵母中加入 30 ml 0.04M NaOH ，在研钵中研磨 均匀，转入 大试管 ，沸水浴 20 min ， 3000 转离心 10min ，取上清，弃沉淀。 2. 上清液 慢慢 倾入 10 ml 酸性乙醇中，边加边搅， 静置沉淀 RNA 后， 3000 转离心 3min ，弃上清，取 沉淀。 3. 将沉淀用 95% 乙醇洗 两次 ， 约 3 毫升 / 管 ，用于除 去表面杂质。 第一次将沉淀捣散后再 3000 转离心 3min ；第 二次将沉淀捣散过滤，旨在将沉淀誊出来，放在 滤纸上凉干，称量。（ 差减法称量，滤纸应提前 称好 ） 4. 将所有提取物转移到小三角瓶 / 大试管中，加 适 量 1.5M 硫酸进行水解，再分别鉴定组份。 二 . 鉴定 1. 鉴定磷组分可适当增加，效果更好。 2. 氨水过量太多也会使沉淀消失；先加硝酸银后加 氨水效果明显。 ? 苔黑酚显色的特异性较差，凡戊糖都有此反应。 ? 准微量 DNA 无影响，较多 DNA 存在，亦有干扰。