辣根过氧化物酶.ppt

2021/3/17 * 四、酶标抗体工作浓度确定 取rhPI（1000 ng/ml）加入最适工作浓度15F3包被的酶标板中; 然后加入1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700和1:800系列稀释的酶标抗体HRP-13A4进行测定; 以P值为1.0时酶标抗体稀释度作为HRP-13A4最适工作浓度。 阳性吸光值达1.0以上,阴性对照吸光值低于0.1时,酶标抗体最大稀释度为1∶500。因此,酶标抗体HRP-13A4的工作浓度为1∶500。 Fig 2-2. Electing the optimal dilute strength of HRP-labeled antibody 13A4 for the capture ELISA. The experiment was carried out in triplicate and the curve represents the average values obtained. 2021/3/17 * 五、最适抗原包被浓度的优化 将包被抗原（RC-BSA）稀释成1.0ug/ml,2.5 ug/ml,5.0ug/ml,7.5ug/ml,10.0ug/ml等五个浓度,包被微孔板,100ul/孔; 竞争抗原浓度为2.0ug/ml; 酶标抗体稀释度为1:500,经孵育、显色、终止后用自动酶标仪分析。 显色的强度在一定范围内与包被的抗原量成正比,但随着包被抗原浓度的增加,显色的强度反而降低,因此,选择5.0ug/ml作为包被抗原量。 L O G O 第三节 酶标记物的制备 2021/3/17 * 一、酶制剂及其底物 作为标记抗体用的酶应满足下列要求: (1) 活性高 (2) 性质稳定 (3) 专一性强 (4) 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 (5) 方法敏感,重复性好,简单易行 (6) 酶的底物易于配制保存,酶及底物价廉 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP),其次还有葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。 2021/3/17 * 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP) HRP比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备。 HRP广泛分布于植物界,辣根中含量高,由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18%。 HRP由多个同功酶组成,分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异,PH5左右。 HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm,一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ表示酶的纯度。 高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。 2021/3/17 * HRP酶促反应 酶促反应的过程: 　　　　　　　 HRP 　DH2＋H2O2────→D＋2H2O 供氢体的种类很多,形成的产物特点不一。目前用得较广泛和较满意的供氢体是:OPD和TMB。另外,还有一种供氢体称ABTS[2, 2-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],灵敏度和稳定性均好。 由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂,因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。 2021/3/17 * HRP常用底物 底物 产物性质 主要吸收峰波长（nm） ABTS 绿色水溶性产物 410、650 OPD 邻苯二胺 桔黄色水溶性产物 492 TMB 四甲基联苯胺 蓝色水溶性产物 加入硫酸或磷酸,产生黄色 370、652 450 DAB 3.3－二氨基联苯胺 不溶性棕色沉淀 免疫组化 Chloronaphthol 产物颜色介于蓝色-蓝紫色,易于成像 免疫印迹、免疫组化 AEC 棕红色沉淀,容易成像 多重染色的第二标记 2021/3/17 * 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP), AP:系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶,由多个同功酶组成。 小牛肠粘膜AP分子量为100kDa,酶作用的最适pH为9.6;大肠杆菌AP分子量为80kDa,最适pH为8.0。 AP作用底物较多,常用的酶底物有对硝基本磷酸盐(PNP)、β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。 AP主要用作双标记染色,研究递质共存及酶免疫测定。AP标记抗体,一般采用戊二醛作交联剂一步法,使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。 2021/3/17 * AP常用底物 底物 产物性质 主要吸收峰波长（nm） pNPP 对-硝基苯磷酸酯 黄色产物----硝基酚 405nm NBT 不溶性黑紫色沉淀 免疫印迹 其它:酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、碳酸苷酶、溶菌酶和脲酶 2021/3/17 * 作