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胶迁移实验步骤 实验步骤 生物素标记探针 1 按如下顺序加入反应物，温和混匀，切勿涡漩 超纯水 25 μl 5 ×TdTReaction Buffer 10 μl 探针 (1 μM) 5 μl Biotin-N4-CTP 5 μl TdT (2U/ μl) 5 μl 37℃反应 30 分钟 2 加入 2.5 μl 0.2M EDTA 终止反应 3 加入 50 μl 酚：氯仿，短暂涡漩， 15000g 离心 2min ，保留上层水相，－ 20 ℃保存。 4 结合反应前等体积混合两条标记引物， 90℃退火引物，并自然冷却至 4 ℃，待用。 抽提核蛋白 6 密度铺 60mm 细胞培养板，培养约 12h 1.2-3 × 10 2.移去细胞培养基， PBS 洗细胞一次 3.加入 1mL Buffer B 于培养板，将细胞刮下收集于 1.5mL 离心管 4.1000g 离心 2min ，吸去上清 5.加入 160 μl Buffer A ，重悬沉淀，冰育 20min 6.加入 40 μl 含 2.5 ％NP-40 的 Buffer A ，涡漩 10s，4 ℃ 15000g 离心 5min 7.吸去上清，加入 40 μl Buffer C ，4 ℃涡漩 25min ，4 ℃ 18000g 离心 5min 8.吸取 2 μl 上清采用 Bradford 法测蛋白质浓度，其余储存于 -80 ℃ 配置非变性聚丙烯酰胺凝胶 (以 6 ％浓度为例 ) 5 ×TBE 1mL 30％Ac-Bi 2mL 40 ％Glycerin 625 μl DDW 6.125mL 10%AP 150 μl 10%TEMED 100 μl 以预冷为 4 ℃ 的 0.5 ×TBE为电泳缓冲液， 100V 预电泳 30-60min EMSA （参考PIERCE 公司试剂盒） 特异性的证明 首次使用的探针序列需证明其是否与目的蛋白特异性结合，确定目的条带的位置。 按照“步骤”中的体系，做以下四组平行结合实验： （在加入 ddw ，10×binding buffer ，Poly(dI.dC) 的基础上 ) 1) 生物素标记的探针 2) 蛋白质粗提物 3) 蛋白质粗提物＋ 200 倍浓度的非标记的同种探针 4) 蛋白质粗提物＋ 200 倍浓度的非标记的突变探针 室温反应 10min ，然后加入生物素标记的探针 室温继续反应 20min ，做 EMSA 检测 结果分析，如果出现如下实验结果 1) 显示游离探针位置 2) 显示游离探针位置和迁移带位置 3) 只有游离带，没有迁移带 4) 和 2)带型一致 则证明探针与目的蛋白为特异性结合。 步骤 1.按如下顺序加入反应物，温和混匀（ 20 μl 体系） ddw ―― 10 ×bindingbuffer 2 μl Poly(dI.dC) 1 μl 核蛋白粗提物 4 － 10 μg （温和混匀） 生物素标记的探针 0.5 μl 室温反应 20min ，加入 6 ×Loadin