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流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 取对数生长期的 A549细胞，按 1×106 cells/ mL 以 1mL接种于 100mm培养皿内 ↓ 24h 后，进行所需的处理（比如加药 , 照射） ↓ 特定时间后终止培养，进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液，洗后的 PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入 15ml 离心管中 ↓ 1000rpm离心 5min（短时低速离心） ↓ 弃上清，用预冷 PBS，1000rpm离心 5min 后去除 PBS和细胞悬液内 的细胞碎片 ↓ 加入预冷 PBS,在涡旋状态下加入无水乙醇，混匀后，于 4℃固 定 30min, 或-20 ℃长期保存。 ↓ 1000r/min, 离心 5min ↓ 将乙醇吸除，加 PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min 再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去 ↓ 吸除离心管内 PBS，加入 200ul PBS 和 2ul 的 RNA酶（ ml） (37 ℃下孵育 30min) ↓ 加入的 50ug/ml 的 PI 溶液室温下避光染色 30min ↓ 将离心管内的细胞过滤 (300um尼龙网膜 ) 至含有 PBS的 EP管中（ PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记 EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机（先开仪器后开软件） ↓ 流式细胞仪的结构一般分为 5 部分：①流动室及液流驱动系统；② 激光光源及光束成形系统；③ 光学系统；④ 信号检测、存贮、 显示、分析系统；⑤ 细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上 ↓ 流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（ 488nm激 发光源） ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞 DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例） ↓ 在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出 结果分析—— Modfit 软件分析 图片拷贝：直接 Ctrl+C —— Flowjo 软件分析 FCM-DNA量分析 1 个细胞增殖群时，可将 DNA 含量分布组方图分 为三部分，即 G0/1 、S、G2M。G0/1 和 G2M细胞峰的 DNA 分布均为 正态分布， S 期可以认为是一个加宽的正态分布 ↓ 检测结果刻录光盘保存 ↓ 关机（先关软件后关仪器，关机前需清洗） 正常细胞 DNA含量： 2n-4n 凋亡细胞：核内 DNA断裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段 DNA 穿膜丢失，胞内 DNA含量减少。 PI 染色后，荧光强度减小而形成一个 DNA含量小于 2n 的分布区（亚 G1峰）。 1、纵坐标 Cell Number ：即计数的有效细胞数； 、横坐标 DNA Content：即 DNA含量； 、G1、G2、S 三期在图中已经标示； 4、右侧数字含义： Dip % at ，即 G1期 DNA含量平均值为； %即 G1 期细胞数占总数的 %；Dip % at ，即 G2 期 DNA含量平均值为， %即 G2期细胞数占总数的 %； Annexin V-EGFP/PI 双染法检测细胞凋亡 基本原理： 磷脂酰丝氨酸（ PS）能与连接素Ⅴ（ Annexin Ⅴ）发生特异 结合； PI 是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进 入已经破损的细胞膜，在嵌入双链 DNA后释放红色荧光， 荧光强度与 PI 结合量呈良好的线性关系。 正常细胞：膜完整， PS不外翻—— PI-/Annexin Ⅴ- 凋亡早期：膜完整， PS翻转—— PI-/Annexin Ⅴ + 凋亡晚期： PS外翻，膜通透性增加—— PI+/Annexin Ⅴ + 坏死细胞：膜严重破损， PS不外翻—— PI+/Annexin Ⅴ + 几乎不存在膜结构—— PI+/Annexin Ⅴ - 实验步骤： 取对数生长期的细胞，按 1×106 cells/ mL 以 1mL接种于培养皿内 ↓ 24h 后，进行所需的处理（比如加入药物） ↓ 特定时间后终止培养，进行下一步的实验 ↓ 细胞用 %胰酶 37℃消化 5min( 胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性） ↓ 加入 PBS制成细胞悬液（移液枪吹打 6-8 次） ↓ 倒置显微镜下观察细胞状态（单个分离悬浮） ↓ 将细胞悬液移入 15ml 离心管中 ↓ 2000rpm离心 5min,PBS 吸除 ↓ 用 PBS 清洗细胞 2 次（ 2000rpm，离心 5min 收集细胞） ↓ 用 400ul 1 ×Binding Buffer悬浮细胞 ( 浓度大约为 1×106 cells/ml) ↓ 在细胞悬液中加入 5ul Annexin V-EGFP ，轻轻混匀后于 2-8 ℃避光条件