常用分子生物学技术的原理及应用.pptxVIP

常用分子生物学技术的原理及应用 The popular technology in molecular biology: principle and application;第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular hybridization  blotting technology;核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可在不同的分子之间形成杂化双链的这种现象。;;（一）印迹技术;（一）印迹技术;2. 印迹(blotting)定义;（二）探针技术; 将探针与固定在NC膜上的DNA或RNA进行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。;二、印迹技术的类别及应用;（一）Southern blotting; 基因组DNA的定性与定量分析。 如对在基因组中特异基因的定位及检测等。 重组质粒和噬菌体的分析。;放射自显影照片;（二）RNA印迹技术(Northern blotting);（二）RNA印迹技术;Northern blotting　结果;;（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹);蛋白质的转移只有靠电转移。 蛋白质的检测以抗体作探针。 用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。 或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。;Western blotting应用;辣根过氧化酶（HRP）使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接（标记一抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此光可经X光胶片感光记录下来。?? ;Western blotting应用;三种印迹技术的比较; 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA芯片技术 (DNA chip);斑点印迹 (dot blotting);The technique offers significant savings in time, as chromatography or gel electrophoresis, and the complex blotting procedures for the gel are not required. However, it offers no information on the size of the target biomolecule. Furthermore, if two molecules of different sizes are detected, they will still appear as a single dot. Dot blots therefore can only confirm the presence or absence of a biomolecule or biomolecules which can be detected by the DNA probes or the antibody. ;;原位杂交 (in situ hybridization);A：正常细胞，两绿两红. B：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号，一绿一红两融合. D：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号，两红两绿一融合，这由于异常染色体上面的BCR和ABL基因分离造成的. E：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号和一个额外的Ph 染色体。一红一绿三融合.;DNA芯片;第 二 节 PCR技术的原理与应用; PCR技术是1985年由美国科学家Kary B Mullis建立的体外扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等突出优点，是分子生物学技术中一项具有革命性的创举。;The Nobel Prize in Chemistry 1993;;;模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ ;PCR反应循环;2. 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段。;（二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析;三、几种重要的