高效液相色谱简介及操作.pptVIP

2021/3/23 * 4 检测系统 主要作用:监测经色谱柱分离后的组分浓度变化,并由工作站记录数据,定性、定量分析。 高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器等。 2021/3/23 * 原理:朗伯-比尔定律 a. 紫外检测器(UVD):应用最广泛的检测器。 特点:使用面广; 灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）; 线性范围宽; 对温度和流速变化不敏感； 可检测梯度溶液洗脱的样品。 缺点:只能检测有紫外吸收的物质,流动相的截止波长应小于检测波长。 2021/3/23 * b. 示差折光检测器 (RID) 原理:监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度。 特点: 通用性检测器; 对温度变化比较敏感,要保持在±0.001℃; 灵敏度低(10-6g); 对溶剂变化敏感,不适用于梯度洗脱。 凡具有与流动相折光率不同的样品组分,均可使用示差折光检测器检测。目前,糖类化合物的检测大多使用此检测系统。 2021/3/23 * c. 荧光检测器 (FLD) 原理: 某些溶质在紫外光激发后能发射可见光(荧光)的性质检测。 特点: 　选择性检测器,灵敏度比紫外检测器高2-3个数量级,可达到 10-12g;选择性好,对流量和温度敏感性低。 缺点:只适合于能产生荧光的物质的检测。 只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。 2021/3/23 * d. 蒸发光散射检测器(ELSD) 通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。 工作原理: 适用检测挥发性低于流动相的组分,主要用于检测糖类,高级脂肪酸,磷脂， 维生素，氨基酸，甘油三酯及甾体等。 适用范围: 2021/3/23 * 5 数据处理系统 该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作,使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。 2021/3/23 * 三、高效液相色谱基本操作步骤 （1）检查电源线连接是否正确后打开电源开关 （2）泵体及流路内的气泡排除 （3）正确连接色谱柱 注意流向标志,切勿反接 2021/3/23 * （4）系统平衡 第一步:先用甲醇或乙腈冲洗流路约20分钟,平衡活化色谱柱,并赶走管路中的杂质和水分。 第二步:平衡色谱柱 方法一:若流动相为有机相与水相的混合物,则第一步完成后，按照分析样品的需要调节有机相与水相的比例后冲洗流路约30分钟后，待基线走平后即可进样。 方法二：若流动相中含有缓冲盐溶液、有机/无机酸，则第一步完成后，先用95%的去离子水冲洗流路约20分钟后，再按照分析样品的需要调节流动相的比例，冲洗流路约30分钟，待基线走平后即可进样。 2021/3/23 * （5）色谱柱平衡后,打开检测器（开灯） （6）测定样品 （7）清洗仪器 色谱柱及流路清洗 进样阀清洗 进样针清洗 2021/3/23 * 四、主要注意事项 1 泵使用的注意事项 防止任何固体微粒进入泵体（用0.22 um或0.45 um的微孔滤膜过滤） 流动相不应含有任何腐蚀性物质,含有缓冲盐的流动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。 泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完,否则空泵运转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、密封圈,最终产生漏液。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。 流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性和分析结果。 2021/3/23 * 2 色谱柱使用的注意事项 3 其他注意事项 色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。 当分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存（一般为甲醇）。 每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。 未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁止直接进样分析。 要注意流动相的脱气。 避免使用高粘度的溶剂作为流动相。 使用新鲜配制的流动相,特别是水溶剂或缓冲液建议不超过两天,最好每天更换。 2021/3/23 * Thank You! 2021/3/23 * 高效液相色谱 High-Performance Liquid Chromatography,HPLC 2021/3/23 * 高效液相色谱概述及原理 主要注意事项 基本操作步骤 高效液相色谱仪的结构 主要内容 1 2 3 4 2021/3/23 * 一、高效液相色谱概述及原理 高效液