染色体显带原理与技术 .ppt

染色体显带原理与技术;一、染色体制备基础知识;精品资料; 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”;（一）细胞周期及有丝分裂;有丝分裂;（二 ）从DNA到染色体;核小体 nucleosome：染色质的基本结构;DNA分子的不同存在形式：染色质和染色体;染???质：根据在分裂期和间期的染色不同，分为;基本概念;二、染色体显带技术;Q带：喹丫因染色后，紫外照射下的明暗带（富含AT的明带，富含GC的暗带）； G带：Giemsa染料染色后所呈现的染色体区带；（AT区是深色） R带：是中期染色体经碱性磷酸盐处理，丫啶橙或Giemsa染色后所呈现的带型，一般与G带正好相反； C带：显示着丝粒结构异染色质及其它染色体区段的异染色质。 T带：是染色体端粒部位经丫啶橙染色后呈现的区带； N带：Ag-As染色，主要染核仁组织者区域的酸性蛋白。 1975年建立了染色体高分辨显带技术。 ;几种显带的制作方法之间的关系;G显带实验原理基础G显带：制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体的特征。;染色体检查过程（G显带）;实验步骤 1. 采血及接种培养 1.1 采血：灭菌注射器抽取外周静脉血3~5ml(绿帽肝素抗凝管） 1.2 接种 在超净工作台中，注射器滴加25滴全血（6号针头）至外周血淋巴细胞培养液中（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清），水平摇动混匀。置37℃恒温培养箱中培养68~72小时。 1.3 终止培养前35~40min，加入秋水仙素，使终浓度达到0.5μg/ml。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。继续培养。 秋水仙素主要作用在于能阻滞微管(纺锤丝)形成，或使已形成的微管 解聚，从而使染色体停留在中期。 秋水仙素浓度大，则处理时间短，如浓度小，则处理时间长。但若秋水仙素加入过量，或处理时间过长，分裂细胞多，染色体凝集和收缩变小，或发生异常分裂现象，甚至染色体破碎，不宜用于观察染色体的形态及计数；秋水仙素加入太少，或处理时间偏短，染色体形态偏长或无中期分裂相。 ;2．制片 2.1收集细胞：将全部培养物吸入刻度离心管中，2000 rpm离心5分钟 2.2 低渗：弃上清液，加入37℃预温的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml，用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置37℃恒温水浴箱低渗处理20~25分钟。 2.3预固定：加入 1ml新配制的固定剂（甲醇：冰乙酸=3：1）或清质剂300ul，用吸管小心吹打、混匀，2000rpm离心5分钟。 2.5 固定： 第一次：弃上清液，加入3ml固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定15分钟， 2000rpm离心5分钟。 第二次：弃上清液，重复固定一次。 第三次： 弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。 2.6 滴片： 吸取少量细胞悬液，滴2～3滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，水蒸气熏蒸，70 ℃ 2小时烤片，待染色。; 3.G显带 3.1 取2.5％胰酶溶液0.5ml，加入50 ml生理盐水染色缸中（终浓度0.025%），用 1N HCl或1N NaOH调节PH7.0左右，置 37OC预温。 3.2 将烤好的玻片标本放入胰酶溶液中处理60秒钟左右（胰酶消化时间需不断调试，摸索。不同时间配制，不同批号胰酶，以及随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间都会变化） 3.3 取出染色体玻片标本，置于37℃预温的生理盐水中，终止胰酶的作用。 3.4 将玻片标本放入37℃预温的1：10稀释的Giemsa染液中，染色5～10分钟。 3.5 自来水冲洗，自然晾干。;;G显带常见问题及处理：;各种组织标本的染色体制作;外周血：5%小牛血清RPMI-1640，+PHA。检查体细胞核型。 骨髓：10 %小牛血清RPMI-1640，不含PHA。检查肿瘤细胞核型。 羊水：标本珍贵。专用羊水培养基，防止母体细胞污染。检查胎儿细胞核型。 绒毛组织：…同上。细胞为细胞团（组织），防止细菌污染。清洗、剪碎后消化成单细胞或者细胞团培养。检查胎儿核型。 脐带血：血液细胞，性质同外周血。一定注意防止母体污染！检查胎儿核型。 活检组织：如实体瘤标本。 细胞系：永生细胞。直接常规制作染色体标本即可。;C显带;实验原理;实验用品;实验方法;4、 2×SSC处理：在60-65℃的2×SSC液中处理90分钟时，用自来