克隆基因的表达.pptxVIP

第四章 克隆基因的表达;;第一节 基因表达的过程;一、基因表达的基本规律;（二）空间特异性 在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性 基因表达伴随时间顺序所表现出得这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性;基因分类： 管家基因 表达很少受环境因素影响 可调节基因 受环境因素的诱导或阻遏 可诱导 可阻遏; 按对刺激的反应性，基因表达的方式分为： （一） 组成性表达 某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因（housekeeping gene）;无论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。区别于其他基因，这类基因表达被视为组成性基因表达（constitutive gene expression） 如微观蛋白基因，糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。;（二）诱导与阻遏表达;三、基因表达调控的生物学意义 （一）适应环境、维持生长和增殖 （二）维持个体发育与分化;基因表达调控的多级调控 （一）DNA水平 基因丢失；基因扩增 基因重排；甲基化修饰 染色质的结构状态 （二）RNA水平 转录水平调控 RNA的转录后加工 mRNA从核内向胞浆转运 mRNA稳定性 （三）蛋白质水平 翻译过程 翻译后加工 蛋白质的稳定性;（二）基因转录激活调节基本要素; 原核表达 外源基因 真核表达;第二节 外源基因在原核中表达;大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 1.全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 2.基因克隆表达系统成熟完善 3.繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 4.被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 ;大肠杆菌表达外源基因的劣势 1.缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 2.缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 3.内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 4.细胞周质内含有种类繁多的内毒素 ;一、宿主菌 受体细胞的基因型：野生型大肠杆菌的基因（指没有发生突变的基因） 野生型加“＋”，突变型加“－”（但后者往往被省略），表示的方法的规则如下：①根据基因产物或作用产物的英文名称，取其单词的第一字母，拼成三个字母并以斜体来表示。如：DNA Adenine Methylase, 即dam。② 变异基因不同，用作用结果的英文名称的前三个字母斜体表示，并加上一大写字母，以示区别。如：Recombination , recA、recB、recC。③ 某个基因缺失时，在该基因型前加“△”。④由于某个基因变异导致大肠杆菌的特征发生变化，也可以用该特征的英文名来表示，但第一个字母要大写，并加上“+”或“r”表示有抗性, 加上“-”则表示敏感。如：Ampicillin(氨卞青霉素)，抗性标记为Ampr, 敏感性为Amp-。 ;①、JM109菌株 ??? 可作为大多数质粒载体的受体菌，也可以用于制备M13等噬菌体载体的单链DNA。该菌株易于培养，并且可以用较多的转化方法进行有效的转化。 α－互补,容易鉴别重组体菌株 ?? ②、DH5α菌株 ???? 一种常用于质粒克隆的菌株。其j80lacZ△M15基因的产物可与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。 ???;;二、原核生物基因表达的特征;乳糖操纵元的结构;3.转录和翻译偶联、连续进行;4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。 5.调控主要在转录水平上。一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。 6.mRNA的核糖体结合位点 含有一个起始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列,SD序列 ;三、原核表达系统的注意事项;四、影响外源基因表达效率的因素;(2)-35区与-10区之间的距离 这两个保守区间的距离越是接近于17bp，启动子的活性就越强。 ;2.翻译起