酶制剂生产技术(shanchu)第一模块酶学基础课件十三酶的浓缩干燥结晶.pptVIP

模块三、酶的分离纯化; 浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。 蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。;学习情境十三 酶的浓缩、干燥、结晶;酶的浓缩、干燥与结晶 ;通常采用的减压蒸发法和实验室常用的超蒸发法，都因效率低、费时等在工业上很少应用。 目前，工业上应用较多的是薄膜蒸发法。薄膜蒸发法，即将待浓缩的酶溶液在高度真空下转变成极薄的液膜，液膜通过加热而急速汽化，经旋风汽液分离器，将蒸汽分离、冷凝而达到浓缩目的。薄膜蒸发器有：升膜式、降膜式、刮膜式、离心式等多种。根据物料不同而加以选择。;超滤浓缩 超滤(ultrafiltration) 浓缩是在加压的条件下，将酶溶液通过一层只允许小分子物质选择透过微孔半透膜．而酶等大分子物质被截留，从而达到浓缩的目的。如果采用不同孔径的膜，同时又具有分级分离的作用; 优点：不需加热，更适用于热敏物浓缩；无相变化、设备简单、操作方便；能在广泛的pH条件下操作等，因此，近年来发展很快。;胶过滤浓缩 ： 利用葡聚糖凝胶等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。 ;聚乙二醇浓缩： 聚乙二醇（polyethylene glycol），简称PEG 。 利用PEG的吸水特性。将PEG涂于装有酶溶液的透析袋上，置于4℃下，干PEG粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。 一般用分子量大的PEG,如PEG 6,000和PEG 20,000，以防止PEG进入蛋白质溶液。;反复冻融浓缩 利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。 ;酶的干燥 酶的干燥多采用冷冻干燥法。 在较低温度下（-10℃-50℃）将酶溶液冻结成固态后抽真空，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，最后酶呈干粉状。也称酶的升华干燥。采用这种方法能使多种酶活性长期保存。 ;注意几个问题： 首先被冻的最好是酶的水溶液。如果混有有机溶剂，会降低水的冰点，在干燥时,样品融化而起泡导致酶变性，同时，会使真空泵失效。其次，如果混有磷酸盐，在冷冻干燥时会引起pH的变化， 例如：PH 7的磷酸盐在冷冻时由于磷酸二氢钠会结晶析出，在溶液完全冷冻以前，pH便变成3.5左右。因此，在冷冻前，需将酶溶液脱盐。;酶的结晶 结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。 是指分子通过氢键、离子键或分子间力按规则并且周期性排列的一种固体形式，由于各种分子间形成结晶的条件不同，也由于变性蛋白质和酶不能形成结晶，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，又是一种酶和杂蛋白分离的方法。 ;结晶的基本原理 结晶形成的过程是自由能降至最小的过程。当自由能降至最小并逐渐达到平衡状态时，溶质分子开始结晶作用。 当溶液处于过饱和状态时，分子间的分散或排斥作用小于分子间的相互吸引作用，便开始形成沉淀或结晶，由于溶液的过饱和，维持水合物的水分子相对减少而且不足，溶质分子相互接触机会增加而聚集.但是,当溶液过饱和的速度过快时，溶质分子聚集太快，便会产生无定形的沉淀。如果控制溶液缓慢地达到过饱和点．溶质分子就可能排列到晶格中，形成结晶。;注意： 第一，要调整溶液，使之缓慢地趋向于过饱和点； 第二，调整溶液的性质和环境条件．使尽可能多的溶质分子相互接触，形成结晶。;结晶条件 酶蛋白分子形状和理化性质较复杂，使之在溶液中的特性也变得复杂,影响其最小溶解度的因素也很多，如电解质的浓度、酶蛋白的浓度、pH、温度等因素； (1)酶的纯度 一般来说，酶越纯，越容易获得结晶，长成单晶的可能性也越大。除个别情况外，一般酶纯度应达到50％以上. (2)酶蛋白的浓度 对大多数酶来说，蛋白质浓度在3—50mg/ml较好。一般来说,酶蛋白浓度越高，有利于分子间相互碰撞而聚合，但是酶蛋白浓度过高,往往形成沉淀;酶蛋白浓度过低，不易形成晶核。;(3)晶种 有些不易结晶的酶，需加入微量的晶种才能形成结晶.在加入晶种前，要将溶液调整到适于结晶条件下，加入的晶种开始溶解，还要追加沉淀剂．直到晶种不溶解为止.当达到晶种不溶解又没有无定形物形成时，静置，促进晶体生长。;(4)温度 结晶温度， 一方面要有利于结晶的生成；另一方面要不超过酶的热稳定性。有些酶对温度很敏感，因此要防止酶失活.从现有资料来看，一