高等动物基因1哺乳动物表达系统.pptxVIP

基因工程 Genetic Engineering; 基因治疗;第一节 高等动物基因工程的基本概念;D 哺乳动物表达系统的基因转移方法;优点：表达的蛋白与天然蛋白在结构、糖基化、磷酸化、寡聚体类型和方式上几乎相同，且能正确组装成多亚基蛋白。如EPO（促红细胞生成素） 缺点：哺乳动物细胞的表达水平低； 获得高表达细胞株所需的时间长； 细胞大规模培养的成本高； 哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的成本较高； ;哺乳动物细胞表达系统的构成;（1）正常的哺乳类动物细胞具有四大生物学特征:;;(3) 常用??高等哺乳动物受体细胞;2. 1981年，Gluzman用编码野生型T抗原但复制起点缺失的SV40，转化允许SV40裂解性生长的非洲绿猴肾细胞CV-1，获得了三个细胞系：COS1、COS3、COS7。这三个细胞系均含有T抗原，保留完全的允许SV40裂解性生长的能力（被广泛地用于瞬时表达系统）。 T抗原作用：当表达产生的T抗原结合到SV40的复制点的DNA调控区，病毒DNA的复制即被启动。 思考：COS细胞作宿主细胞表达的优势？;3. BHK-21：1961年从地鼠幼鼠的肾脏分离而来成果：用它表达的重组凝血因子VIII已获准投放市场。 4. C127细胞：来自RIII小鼠乳腺肿瘤细胞，特别适用于带有牛乳头瘤病毒（BPV）载体的转染：用C127细胞生产的重组人生长激素（hGH）已获准投放市场，用于治疗生长激素缺乏症。 5. MDCK细胞：1958年从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离获得的，是贴壁生长的上皮样细胞：有报道用该细胞结合人巨细胞病毒早早期启动子可高效表达分泌蛋白，表达量占细胞分泌蛋白质总量的15%～20%。;(4) 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记;二氢叶酸还原酶（DHR）;黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）;高等哺乳动物受体细胞的遗传标记;高等哺乳动物受体细胞的遗传标记;（三）哺乳动物细胞载体系统 ;（1）病毒类载体;1. 人腺病毒DNA;20;腺病毒感染细胞过程;人腺病毒DNA;重组腺病毒表达载体构建原理;2)转移载体;3)构建重组腺病毒表达载体;(续);人腺病毒DNA;2. 猴多瘤病毒DNA（SV40）;猴多瘤病毒DNA（SV40）;猴多瘤病毒DNA（SV40）;猴多瘤病毒DNA（SV40）;猴多瘤病毒DNA（SV40）;3. 人乳多瘤病毒DNA（BKV）;人乳多瘤病毒DNA（BKV）;4. 人牛痘病毒DNA;人牛痘病毒DNA;人牛痘病毒DNA;;(1) 哺乳动物细胞的物理转化法;哺乳动物细胞的物理转化法;哺乳动物细胞的物理转化法;电转化设备;哺乳动物细胞的物理转化法;脂质体介导的基因转移技术;哺乳动物细胞的物理转化法;(2) 哺乳动物细胞的病毒转染法;;(1) 提高哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本方法;一、载体改造; 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊;DHFR-MTX高效表达系统;GS-MSX高效表达系统;具体实例：将选择基因通过一段寡聚核苷酸连在目的基因的3′端（如图）。前体mRNA 在翻译时, 位于目的基因3′端下游的共扩增基因的翻译起始的效率大大降低, 导致翻译水平明显低于上游的目的基因.;1）在载体上添加染色体上的某些特定序列;(2) 转录水平; 在载体上安装病毒或细胞来源的强启;1、选择高效多聚腺苷酸加尾信号( pA) 真核基因的hnRNA 的加工过程需要多聚腺苷酸加尾信号(pA)。前者多采用SV40 的晚期及早期pA、牛生长激素基因的pA 和人工合成的 pA.;2.剪接信号的运用;2.提高转录因子的表达水平;(4) 翻译水平;1. 添加Kozak序列; 内部核糖体进入位点（IRES ）是从细小RNA 病毒中发现的，由它连接的开放阅读框架可以同时翻译。IRES 序列被广泛应用于构建双顺反子或多顺反子哺乳动物细胞表达载体。 用IRES 构建多个顺反子表达载体， 可以表达多亚基蛋白。;3. 通过翻译增强子提高翻译效率;（1) 利用密码子的偏好性 根据密码子的偏好性，在不改变蛋白质编码序列的前提下尽量使用CHO细胞常用的密码子对基因进行改造 实例：Kim 等用人高表达基因偏爱的密码子系统地设计了人的EPO 基因， 再以酵母偏爱的密码子编码人的EPO基因作对照来比较优化后的人EPO 基因的表达效率。结果表明，优化的人EPO 基因密码子比非优化的人EPO 基因密码子的表达效率高2－3 倍。;（2) 尽量使用基因组DNA 基因组DNA 比cDNA 表达量要高。 因此，在可能的条件下，尽量使用基因组DNA。 若用cDNA，则尽量切除cDNA中的不必要序列，一