耐氨苄西林流感嗜血杆菌产β-内酰胺酶机制研究..docxVIP

耐氨苄西林流感嗜血杆菌产 3-内酰胺酶机制研究 摘 要目的：探讨耐氨苄西林的流感嗜血杆菌产生 3 -内酰胺酶的机制。：对 临床分离的 112 株流感嗜血杆菌耐药菌用纸片法作 3- 内酰胺酶测定，用 PCR 法检测产酶流感嗜血杆菌中的 3 -内酰胺酶基因的存在。结果：纸片法测得产 酶菌株 32 株，产酶率 28.6 ％(32/112) ；32株产酶菌中 PCR 摘 要 目的：探讨耐氨苄西林的流感嗜血杆菌产生 3 -内酰胺酶的机 制。：对临床分离的 112 株流感嗜血杆菌耐药菌用纸片法作 3 -内酰胺酶测 定，用PCRt检测产酶流感嗜血杆菌中的 3 -内酰胺酶基因的存在。结果：纸 片法测得产酶菌株32株，产酶率28.6 % (32/112) ; 32株产酶菌中PCR法测 3 -内酰胺酶基因阳性菌株29株，阳性率为90.6%(29/32)，其中质粒DNA莫板 组阳性为25株，基因组DNA模板组阳性为4例。结论：(1)流感嗜血杆菌耐氨 苄西林主要由质粒介导产生 3 -内酰胺酶所造成。(2)PCR法是流感嗜血杆菌是 否携带 3 - 内酰胺酶基因及该基因所在位置的简便而有效的方法。 自 1972年第一次发现流感嗜血杆菌因产 3 -内酰胺酶而致耐氨苄西林以来 ［1］，国外对耐氨苄西林流感嗜血杆菌的耐药机制以及产 3 -内酰胺酶的分子 基础研究 ,呈逐年增加趋势。 1978年 Bryan 等［2］首次报道了质粒介导产生 3 -内酰胺酶的流感嗜血杆菌。此后，围绕流感嗜血杆菌中的质粒编码 3 -内酰 胺酶及其与耐氨苄西林的关系进行了许多研究。我国由于流感嗜血杆菌的分离 率较低，对此的研究一直没有深入。本文作者在本实验室成功提高流感嗜血杆 菌分离率的基础上［ 3,4］，分离获得 36株耐氨苄西林的流感嗜血杆菌，用纸 片法测定它们产3 -内酰胺酶的情况后，用PCF方法对产酶菌中3 -内酰胺酶基 因的存在与否进行了检测，对耐氨苄西林的流感嗜血杆菌产生 3 -内酰胺酶机 制作了初步。 材料和方法 流感嗜血杆菌的分离培养 收集痰或咽拭子标本，于 1 h 内接种于改 良的哥伦比亚巧克力琼脂平板中，置 5% CO2孵箱，37C孵育18?24 h,对疑似 流感嗜血杆菌的菌落分别于血琼脂和营养琼脂平板上作卫星试验，仅在血琼脂 平板上卫星试验阳性者为流感嗜血杆菌。用常规的纸片法( K-B 法)对每个菌 株作体外药物敏感试验，根据美国 NCCLSS准判读药敏结果。从平板上挑取耐 氨苄西林的单菌落接种于含3 ml液体HTM培养液的试管中，于5% CO2孵箱 37 C孵育培养过夜，离心收集菌体用于质粒制备等后续实验。 纸片法测定B -内酰胺酶 将流感嗜血杆菌培养物经超声裂解后直接 涂布于B -内酰胺酶纸片上，在15 min内变红者为阳性。超声仪为 Bran son Sonifier 250 ,B -内酰胺酶纸片购自Oxid公司。 PCR法检测B -内酰胺酶基因 1.3.1 PCF引物 针对B -内酰胺酶结构基因的PCF引物由本校分子遗传 学开放实验室用PCGEN软件PCRPLA程序设计，上海生工生物工程公司协助合 成。引物序列为：上游引物：5 TGGGTGCACGAGTGGGTTA下游弓I物： 5 TTATCCGCCTCCATCCAGTC3 1.3.2 PCR反应条件 用PE2400型 DNAT增仪,50卩l PCR反应体系中含 有模板DNA 1卩l、上游下游引物各1卩l (浓度为25卩mol/L )，10X缓冲 液5卩l，dNTP昆合物(10 mmol/L) 4卩l，并用ddH2O补足至50卩l ( Mg2+ 的终浓度为 1.5 mmol/L )，以 94°C 3 min — (94 °C 1 min — 55°C 1 min — 72°C 1 min，循环30次)—72C 7 min — 4C保温。PCR反应后取10卩l产物点样， 进行琼脂糖凝胶电泳并拍照。 1.3.3 PCR莫板的制备 细菌质粒DNA用常规碱裂解法分离、RNase I消 化、酚/氯仿抽提纯化[3];细菌基因组DNA用菌体冻融法制备：取少量细菌 于1.5 ml塑料离心管中，用蒸馏水重悬，加入少量溶菌酶于 37C水浴5 min， 放入液氮迅速冰冻5 min，取出后立即放入37C水箱融化5 min，重复冻融3 次，室温下 1X104 r/min 离心5 min ，吸取上清液到新的离心管，加入 1.5 倍 体积的无水乙醇于-20C沉淀30 min，1.5 X 104 r/min 离心沉淀，用10卩l TE溶解后备用。 结果 2.1 流感嗜血杆菌的分离 自 1997年10月至1998年11月,从我院呼吸 内科及耳鼻咽喉科呼吸道感染患者中收集 634份痰及咽拭子标本，分离鉴定出 112株流感嗜血杆菌 ,其中，药