第五章酶与细胞固定化技术.docxVIP

海藻酸钠与 海藻酸钠与Ca2+,Mg 2+,AI 3+等多价离子间的转移凝胶作用 ,形成固定化细胞颗粒 第五章 酶与细胞的固定化技术 教学目的： 定化技术， 教学重点、 原生质体） 教学方法： 教学手段：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）的概念及意义，掌握酶的常用固 了解固定化酶的性质。 教学目的： 定化技术， 教学重点、 原生质体） 教学方法： 教学手段： 难点：固定化酶（细胞、原生质体） 的范畴，各种固定化技术。 固定化酶 （细胞、 的范畴 ,半透膜包埋法。 讲授 多媒体 第一节 概述 一、游离酶使用中的局限性 : 提取纯化繁琐 ,价格昂贵 难以重复使用 稳定性差 DL-AA 连续生产 L-AA 实现二、固定化酶研究 克服游离酶缺点的方法之一 50年代开始 60 DL-AA 连续生产 L-AA 实现 三、基本概念 1、固定化酶（ 1971第一次国际酶工程学术会议） （ Immobilized Enzyme） 指在一定空间范围内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收 重复利用。包括酶与不溶性载体结合的 “固相酶 ”“水不溶性酶 ”及包埋在凝胶或超滤装 置中的酶。 2、固定化细胞（原生质体） 指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范围 内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。 四、固定化酶优点 增加了酶的稳定性 能降低酶的总体费用 酶的分离和回收变得容易，并可重复使用 使反应过程的连续操作成为可能 反应产物也易于提取纯化 有利于过程设计和优化 拓广了酶的应用范围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等） 第二节、酶的固定化方法 一、酶的固定化方法 1、酶的固定化方法（四大类方法） 1）吸附法 2）包埋法 3）交联法 4）化学共价法 其它（酶的逆胶束包囊法） 2、 ⑴ ⑵ ⑶3.⑴⑵ 2、 ⑴ ⑵ ⑶ 3. ⑴⑵ ⑶⑷ （一）吸附法 1、原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（范德华力、离子键和氢键），使细胞固定 在载体上，常用的吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。 然后此外还可利用专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白A与a—甘露聚糖具有亲和 力，而酿酒酵母细胞壁上含有a—甘露聚糖， 故可将伴刀豆球蛋白A先连接到载体上， 把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上。 然后 2、 酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶系。 3、 优缺点：操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体廉价易得，且可反复利用； 缺点是蛋白质与载体之间的结合相当弱 ,而且很多情况下 ,酶的非特异性吸附常常会引 起部分或全部失活 ,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附 .因此当要求酶 的固定绝对牢靠时 ,采用吸附法是很不可靠的 . 4、 常用吸附剂 各种矿物质以及无机载体 （氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空陶瓷，多空玻璃， 羟基磷灰石等 ），及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最常用的吸附剂是离子交换剂羧 甲基纤维素， DEAE 纤维素、 DEAE 葡萄糖，合成的阴离子和阳离子交换剂离子 交换剂主要靠静电吸引，缺点是当离子强度增加或介质的 pH、温度变化时，这种结合 发生分解。 5、 举例： 10mM NaAc pH4.510ml NaAc PBS将伴刀豆球蛋白 A-琼脂糖 4B 50ml （在 10mM PBS pH 7.4 含 0.5M NaCI,1mM CaCI 2和 1mM Mn Cl 2）与酶液（10mg/ml） 5ml,在4 C, 10mM NaAc pH4.5 10ml NaAc PBS （ 1mMCaCl2 和 1mMnCl 2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于 中备用。 （二） 包埋法 可分为凝胶包埋法1、 概念：指将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中,使酶固定的方法。 可分为凝胶包埋法 （网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。 另外网格结构影 所以此法只适合2、 优缺点：一般不需酶的 AA残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高； 另外网格结构影 所以此法只适合 缺点是包埋时发生化学聚合反应,酶易失活,须巧妙设计反应条件。 响底物和产物的扩散,有时,这种扩散会导致酶动力学行为的改变, 于小分子底物和产物的酶。 3、 海藻酸盐包埋法 缺点 : 在高浓度电介质（K+,Na+）溶液中，固定化颗粒变得不稳定. Ca2+等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀 ，固定化颗粒溶解 优点 : 海藻酸盐价格便宜 包埋条件温和 4、角叉菜糖包埋法 它能立即K-角叉菜是一种含有许多硫酸根基团的多糖化合物 .在K+离子存在下， 它能立即 生成凝胶 . 缺点 : 对高浓度的Na+离子敏感 固定化温度高需要在37C ~