无缝克隆,同源重组克隆.docx

简介(INTRODUCTION ) 原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。它只需要将基因片段 和需要的三种酶混合在同一个管内在 50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的 DNA。 装配原理基于 DNA片段间的重叠区域， 过程依赖于三种酶： DNA外切酶(T5 exonuclease), ctsDNA iragmente wrfh oueiiaopna ends A A+B Fully DNA 高保真 DNA聚合酶。(Phusion polymerase )和耐热 DNA连接酶 (Taq DNA ligase)的共同 作用。首先，T5核酸外切酶消化 DNA片段的链 方向是从5到3每个DNA片段分别形成 一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以 DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。然后，在空缺的部分 DNA聚合酶以另一条 DNA 单链为模板，沿 3方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两 条DNA单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重叠区域的 DNA片段就组装成一整条 DNA分 子了。下面是组装的示意图。 材料(MATERIALS ) 试齐U( REAGENTS NAD，H2O , 1 M MgCl2, 1 M DTT, 10 mM dNTP mix, 1 M