定量pcr技术实验解析.pptxVIP

实时荧光定量PCR技术研究进展与应用;实时荧光定量PCR的原理;常规PCR;在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 ;什么是荧光;基本结构;常规vs实时;常规vs实时;实时荧光定量PCR原理 定量原理;实验数据;实时荧光定量PCR原理之　如何定量;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——原理篇;定量原理;定量方法：初始模板量的对数与C(T)循环数之间呈线性关系 ;荧光信号如何产生？;SYBR Green 1;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——原理篇; SYBR Green I 工作原理;SYBR Green 法 ------------PCR反应的建立;SYBR Green 法 应用范围;利用SYBR Green 法定量检测样品DNA;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——原理篇;延伸反应: Taq酶切下5’端荧光素出现荧光 ;TaqMan 探针 PCR反应的建立;TaqMan探针 应用范围;小结;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用;绝对定量与相对定量;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇;;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇;F;两条探针分别针对不同等位基因;;实时荧光定量PCR技术研究进展与应用;实验方案设计 普通PCR实验条件的优化 定量PCR实验条件的优化 定量PCR常见实验问题的处理;实验方案设计——确定实验的目的 　　两个明确： 　　1.明确需要的是绝对定量还是相对定量； 　　2.明确是否采用质粒系统进行定量。;实验方案设计——详细理解实验分组 　　1.如果是绝对定量——简单，直接用标准曲线 　　2.如果是相对定量，要明确需要进行比较的组间和组内样本（是否采用一组或一个样本作为全部实验的对比组）;实验方案设计 普通PCR实验条件的优化 定量PCR实验条件的优化 定量PCR常见实验问题的处理;普通PCR优化——最终目的保证实验的特异性 　　1.引物设计三原则——紧密互补、无引物二聚体、无错配； 　　2.反应温度的优化——梯度PCR实验　 　　;梯度与非梯度实验对比;优化变性温度有时也是重要的;多重PCR反应中优化温度;普通PCR优化——最终目的保证实验的特异性 　　3.其它条件的优化 　　　Mg2＋浓度的优化、引物浓度的优化、模板的优化等……　 　　;实验方案设计 普通PCR实验条件的优化 定量PCR实验条件的优化 定量PCR常见实验问题的处理;定量PCR实验的优化 SYBR Green I Taqman的实验优化;定量PCR实验的优化——SYBR Green I 基本要求：产物大小在150－300bp间比较合适；对GC含量没有特别的要求。适用于大多数的定量PCR实验需要。 ;定量PCR实验的优化——SYBR Green I 1.普通PCR的实验条件摸索很重要——目标是达到没有非特异性的扩增； 　;定量PCR实验的优化——SYBR Green I 2.普通PCR无法达到完全的优化——利用读板温度设定解决 　前提：没有Tm值高于目的产物的非特异产物 　;存在非特异性产物时的熔解曲线;定量PCR实验的优化 SYBR Green I Taqman的实验优化;定量PCR实验的优化——TaqMan 基本要点：对实验设计要求较高，引物要与探针相匹配；扩增的长物片段一般为120－200bp左右；结合的唯一性。;定量PCR实验的优化——TaqMan 1.探针设计 　探针长度在15－20个bp长度间合适，不超过25个bp； 　探针的Tm值比引物的要高5－10℃，可以应用MGB； 　探针的结合位点要靠近5’端； 　;1 确保G-C含量在20-80%之间。 2 探针5 端的第一个碱基不能是G, G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号 。 3 用Primer Express?软件计算出来的探针Tm值应当在68-70°C 之间。 4 探针要尽可能地短，但是不要短于13个碱基。 5 避免同一碱基重复过