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RT-PCR方法对禽流感NA基因的分型 　Abstract：迄今为止，已确定9禽流感病毒神经氨酸酶（NA）的亚型。为了能更迅速的区分禽流感病毒的NA，对其进行了RT-PCR。在分析了GenBank509个完整的NA序列的基础上，设计了九对NA RT-PCR的特异引物。设计的引物能扩增部分NA的基因，并且对于每一个NA的亚型（N1—N9）是独一无二的。同时在一套分开的管子中进行九个RT-PCR，通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色后，NA的亚型被确定，与传统的序列分析法和禽流感病毒分离法比较，在确定禽流感病毒NA亚型方面，RT-PCR的方法有高达97.3％的敏感性和91.1％的特异性。结果表明，RT-PCR方法比传统方法更具敏感新和特异性。 　1、前言： 　禽流感病毒（AIVs）某些毒株是危害动物和人类公共卫生的人畜共患病。一般来说，AIVs对其自然宿主野生水禽是不致病的(Sturm-Ramirez et al.，2004)，但有时它们在传播到其他物种时可能造成高的发病率和死亡率，其中包括家禽和哺乳动物(Vines et al.，1998；Fouchier et al.，2005)。AIVs也时常传播给人类，尤其是H5、H7、H9三个亚型。这也使得人们提高了对可能发生的新流感病毒的大流行的关注，并要求全面控制禽流感的迫切性。 　A型流感病毒是在他的两个表面糖蛋白（HA、NA）的基础上区分亚型的。迄今为止，已经分离了A型流感病毒的16个HA型和9个NA型（Fouchier et al.，2005)。A型流感病毒的复杂的生态学特性和高的变异性使得对其的控制构成严峻挑战。对于A型流感病毒的流行传播，广泛系统地对国内水禽和野生水禽的监控有着重要的意义。病毒敏感性和特异性的检测和毒株的分型是调查其流行病学的先决条件，也是防控流感爆发的重要战略。 　诊断AIVs的方法多种多样。AIVs的HA和NA的亚型通常由HI和NI实验辨别（世界动物卫生组织陆地动物诊断试验和疫苗手册，2008），这些方法都是在抗原抗体、免疫交叉反应的基础上建立的，具有很多局限性，如主观臆断、特异性低、敏感性低和精确性低等（Herrmann et al，2001； Fouchier et al，2005；Hoffmann et al，2001）。HA和NA的基因测序和序列分析为AIVs亚型的鉴定提供了一种准确度高、灵敏度好、具有重现性的工具。目前，这种方法作为一种特性分析法被很多研究单位和实验室采用(Herrmann et al，2001；Fouchier et al，2005)。然而，DNA测序是一项昂贵而且耗时耗力的工作，另外，五套全引物被应用到NA全部序列的扩增，很难挑选到合适的引物。因此，研究一种快速、敏感的NA分型方法是必要的。 　在过去十年中，许多报告表明使用基于PCR的诊断测试的优越性(Li et al.,2001；Poddar,2002；Kessler et al，2004)。RT-PCR已经被应用于鉴别NA1-NA5(Lee et al，2001)和HA1和HA2(Stockton et al，1998)。PCR方法被认为是鉴别HA、NA亚型的最敏感、特异性最高的方法之一(Schweiger et al，2000；Hoffmann et al.，2001；Horimoto and Kawaoka，1995)。 　虽然亚型特异性引物已被用来区分N1-N9病毒，但是由于GenBank中可用的NA引物序列有限，使得检测结果不太良好或者检测不出。近年来，大规模的完整NA序列已经向GenBank递交。因此，尝试构建RT-PCR的方法快速、敏捷的区分AIVs是对常规方法的一种补充。 　2、材料和方法 　2.1   病毒 　本研究一共考察了101份毒株（表1），分别由中国农业大学兽医学院和扬州大学兽医学院提供。所有病毒采用9日龄鸡胚繁殖，提取尿囊液于-70度储存备用。 　2.2   病毒分型的常规方法 　101份毒株的HA亚型采用先前提到的HI抗体血清反应进行分辨，NA亚型采用序列分析进行分辨。简而言之，这些病毒的NA基因通过PCR扩增后，扩增产物被克隆到pGEM-T载体中，NA的亚型通过在NCBI上病毒核苷酸序列的BLAST搜索而得到分辨。本次研究的NA基因序列已经上传到GenBank。 　2.3   RT-PCR引物 　为了设计NA的RT-PCR特异性引物，在GenBank中找到了509个完整的NA序列及AIVs所有的NA亚型序列并对他们进行分析。这些NA基因的核苷酸序列通过LASERGENE试剂盒运用Clustal V的方法进行比对。(DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)。通过序列分析和比对，九对特异的NA基因引物被设计，并且每个引物都是针