在结直肠癌中的表达及其功能初步.docx

南方医科大学 硕士学位论文 Has-miR-106b在结直肠癌中的表达及其功能初步研究 姓名：郑林 申请学位级别：硕士 专业：病理学和病理生理学 指导教师：丁彦青IIIIII IIIIII IllIII IIII 111 Iilllll l Y1 997590 硕士学位论文 Hsa．miR．106b在结直肠癌中的表达及其功 能初步研究 硕士研究生：郑林 指导教师：丁彦青教授 王爽副教授 摘要 结直肠癌(colorectal cancer，CCR)是常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率呈 逐年上升的趋势。临床上有一半以上的结直肠癌患者在行根治性手术前己出现 了微转移，50％术后患者发生肝转移，是患者死亡的主要原因。因此，阐明结直 肠癌发生和转移的分子机制，是结直肠癌研究的重要内容。 表观遗传学已成为后基因组时代一个重要的新兴前沿。近年来，有关表观 遗传学调控机制与结直肠癌发病风险、疾病进程、预后等的关系受到越来越多 学者的关注，其中以有关DNA甲基化和microRNA调节的研究报道居多。 microRNA(miRNA)是一类长约17．25核苷酸(nucleotide，nt)的非编码的小 RNA。通过与靶基因的高度互补结合而降解mRNA或抑制其翻译来导致基因的 沉默，改变基因的表达，与动植物的组织器官发育、细胞分化和凋亡、脂肪代 谢等生命活动密切相关，其表达异常将导致重大疾病，例如肿瘤的发生。miRNA 的表达水平在许多肿瘤中发生改变，它们可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。 其中有一些miRNAs在基因组上成簇存在，并以多顺反子的形式进行转录。 has—miR-106b，长2Int，它的前体pre—mir-106b，全长82nt，位于染色体7q22．1 上。miR-106b所属的miR-106b．25基因簇高度保守，编码miR-106b、miR-93、 中文摘要miR-25，定位在宿主基因MCM7的13号内显子的位置，和宿主基因的初始转录 中文摘要 miR-25，定位在宿主基因MCM7的13号内显子的位置，和宿主基因的初始转录 本共同转录，这种平行的表达趋势在肝、胃、前列腺等恶性肿瘤中都有发现。 miR-106b一25基因簇在胃癌、-h；JY0腺、胰腺、神经内分泌肿瘤、神经母细胞瘤、 多发性骨髓瘤等不同类型的肿瘤中高表达。 Guo J等利用基因芯片技术研究发现胃癌中miR-106b的表达水平要高于周边 正常组织，miR-106b不但在胃肿瘤病变部位发生异常表达，在循环系统的外周 血液中亦有异常表达，胃癌患者血液中miR．106b的表达要比正常人高。在淋巴 结转移阴性的结直肠癌组织中miR．106b的表达要高于周边正常组织。miR．106b 在肝细胞癌中高表达，并靶向调控E2F1，抑制肿瘤细胞的凋亡、促进其增殖。 在胃癌肿瘤细胞中E2F1和miR．106b形成相互调节的反馈环，并能通过抑制 transforming growth factor-13(TGFl3)来促进细胞的增殖。在人的永生化乳腺上皮细 胞中，在靶向调控p21调节细胞增殖过程中，miR-106bO邑够通过促进由G1期向S 期的转变，促进细胞的增殖。在miR-106b与恶性肿瘤患者的临床相关性研究中 发现，。肾细胞癌miR．106b在肿瘤组织中较之正常组织中表达水平明显升高，在 转移患者中的表达水平要低于未转移的患者，此外，miR．106b是肾癌患者术后 的一个预后指标。上述研究表明，miR-106b在肿瘤中发挥重要的作用。 研究已证实miR．106b在很多常见恶性肿瘤中表达异常，但其在结直肠癌中 作扮演的角色和具体的作用机制仍不清楚，因此，本课题拟在检测及确定 miR-106b在结直肠癌组织和细胞株中表达的基础上，通过改变结直肠癌细胞中 miR-106b的表达水平观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响，初步探讨miR-106b 在结直肠癌发生、发展过程中的作用，为阐明结直肠癌发生及转移机理提供重 要理论依据。 方法 l采用RT-PCR的方法，检澳iJ30例结直肠癌组织标本及其配对的正常组织和 HT-29、SW480、M5、LOVO、SW620、SCPl7、SCP26、SCP51等结直肠癌细 胞株中miR-106b的表达。 ll 硕士学位论文2通过克隆重组miR-106b前体序列，构建慢病毒表达载体 硕士学位论文 2通过克隆重组miR-106b前体序列，构建慢病毒表达载体 plVTHM／miR-106b，病毒包装后感染SW620细胞，通过流式细胞仪分选鉴定稳 定过表达miR．106b的结直肠癌细胞株SW620．plVTHM／miR．106b。通过MTT、 平板克隆形成实验和流式细胞术检测miR一106b过表达对细胞体外增殖能力的影 响，采用Tran