体外干扰肌肉生长抑制素基因的分析.docxVIP

牟志霞：miRNA体外干扰肌肉生长抑制索基因的研究 牟志霞：miRNA体外干扰肌肉生长抑制索基因的研究 。 以获得绵羊肌肉特异的启动子miKNA双表达载体为目标，我们以绵羊基因组 DNA为模板，用PCR方法扩增得经生物信息学分析正确的绵羊的肌肉生长抑制素 (myostatin，MSTN)启动子序列并对绵羊MSTN启动子进行了转录结合位点的 分析；通过构建携带Myostatin基因启动子(Pro)序列特异性报告载体 pEGFP—MSTN，转染羊肌卫星细胞和羊成纤维细胞，研究绵羊Myostatin基因的启 动子(Pro)能否驱动报告基因在羊肌卫星细胞和成纤维细胞中表达及表达特异性。 结果表明，pEGFP．MSTN仅在羊肌卫星细胞中表达，在成纤维细胞中不表达，然 而携带CMV启动子的pEGFP-N1阳性对照质粒转染羊肌卫星细胞和羊成纤维细胞 后，均能驱动报告基因在羊肌卫星细胞中表达和在成纤维细胞中表达。这表明 Myostain基因表达的肌肉特异性源于启动子的特异性，这将为后续肌肉特异 miRNA双表达载体构建奠定基础。 以获得miRNA筛选报告载体poMSTN．EGFP为目标，我们以绵羊或山羊肌肉 组织提取总RNA为模板，用RT．PCR扩增得经生物信息学分析正确的绵羊 MSTNcDNA序列；将序列正确的eDNA克隆入pEGFP-N1的XhoI／BamHI位点， 获得miRNA筛选报告载体poMSTN．EGFP，将pEGFP-N1和poMSTN．EGFP报告 载体分别转染小鼠成纤维细胞，用荧光观察和RT．PCR检测miRNA筛选报告载体 poMSTN．EGFP在小鼠成纤维细胞中能否正确表达。结果表明，携带CMV启动子 的pEGFP-N1阳性对照质粒和poMSTN．EGFP均能驱动报告基因在小鼠成纤维细 胞中表达，并通过RT．PCR检测到融合基因的表达。这将为筛选有效抑制绵羊 MSTN基因的miRNA分子奠定基础。 肌肉生长抑制素是肌肉生长的负调控因子。本研究为了得到有效抑制绵羊 MSTN基因的miRNA分子，设计5对miRNA寡聚核苷酸引物，经退火合成5个 shRNA，将其克隆入miRNA表达载体pcDNA5．miR，构建miRNA真核表达载体， 将miRNA真核表达载体与poMSTN．EGFP报告载体共转染3T3细胞。结果显示， 扬州大学硕士学位论文 扬州大学硕士学位论文 U ●一 5条miRNA分子中均对MSTN基因有显著的抑制作用，其中pcDNA5-miR—shRNA 364，pcDNA5-miR-shRNA369对MSTN干扰效果较好，这将为后期定量分析 pcDNA5-miR．shRNA364，pcDNA5一miR-shRNA369对MSTN干扰效果奠定基础。 关键词：Myostain；MSTNcDNA：miRNA；3T3细胞；转染 牟志霞：miRNA体外干扰肌肉生长抑制素基因的研究 牟志霞：miRNA体外干扰肌肉生长抑制素基因的研究 III Abstract To clone sheep myostatin promoter for construction of short interference RNA(siRNA)expression vectors in sheep cells，a putative sheep myostatin promoter from sheep genomic DNA was amplified by PCR．After sequencing and bioinformatics analysis by online software revealed the presence of the critical transcription binding sites．The putative promoter was inserted into the reporter plasmid pEGFP·N 1 that can express green fluorescence protein and pEGFP-MSTN recombination vector was constructed．The transcriptional regulation activities of pEGFP—MSTN recombination vector were analyzed by detecting the fluorescence strength of EGFP in Sheep skeletal muscle satellite cells and skin flbroblast transfected with the vectors．The results indicated