多肽抗原设计与抗体制备.pptx

多肽抗原的设计与抗体制备多肽抗原的设计多肽的固相合成和纯化多肽的交联和免疫抗多肽抗体的检测和功能学鉴定抗体的纯化怎样利用Internet 的免费资源寻找与抗体相关的信息 抗合成肽类抗体制备程序免疫原性肽的选择肽的合成、纯化与鉴定载体蛋白的选择连接剂的选择载体蛋白/肽连接物ELISA筛选抗体血清反应性免疫动物McAb的制备Western blot, Immunofluorescence assay 鉴定抗体的生物学功能收集阳性血清阳性抗体的纯化抗体制备常用的免疫原 1：表达纯化一段或全长的重组的带GST,Histag的融合蛋白 Abnova corporation 2：利用合成肽制备抗体 AVIVA SYSTEMS BIOLOGY LIFESPAN BIOSCIENCES 3：利用纯化的天然蛋白免疫原性肽选择的基本程序利用在线设计软件或DNAStar筛选抗原性强的多肽序列尽量使用N端或C端的序列该序列经Blast后在人的其他蛋白中同源性要低，最好在小鼠或大鼠中高度保守用peptide companion 软件判定易于合成的14-16个氨基酸免疫原性肽选择的注意事项避开信号肽，磷酸化，糖基化位点避开很多蛋白所共有的相同的或相近的motif,例如zinc finger，SH2 domains ，GTP binding sites 。有些蛋白在成熟的过程中会切割掉一小段肽段。如果选用MBS交联方法，需要在N端或C端加上C对于有些基因来说，可能含有不止一个转录异构体（transcript variants ），这时就要在这些转录异构体的共有序列中寻找抗原多肽 利用Swiss-Prot数据库辅助设计../UniProtKB-Swiss-Prot%20entry%20P26992%20%5bCNTFR_HUMAN%5d%20Ciliary%20neurotrophic%20factor%20receptor%20alpha.htm..\UniProtKB-Swiss-Prot entry P26992 [CNTFR_HUMAN] Ciliary neurotrophic factor receptor alpha.htm多肽的固相合成此法的基本过程是：基于Fmoc化学合成，将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子保护性氨基酸的羧基（已经活化）作用（用NMM,HBTU作偶联剂）形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。合成原料Fmoc-AA(prot)-Wang resin 提供肽链延伸反应的固相颗粒状介质 例如：Fmoc-His(Trt)-Wang resin Prot：Boc,tBu,Trt,OtBu 侧链活性位点的保护基团 Fmoc: α-NH2保护基团： Boc: Trt: Fmoc-AA(Prot)-OHSolvent 1: DMFSolvent 2: 20%pipdine/DMFSolvent 3: 0.4M NMM/ HBTU/DMFSolvent 4: 50% ACN/DMFSolvent 5: methylene chlorideSolvent 6: 94% TFA/2.5%EDT/1%Anisol/2.5%H2O标准合成程序Step solvent/operation volume mix time drain Rep 1 DMF 1 00:00:30 on 3 2 20%pipdine/DMF 1 00:07:00 on 2 3 DMF 1 00:00:30 on 6 4 Reagent(AA) 1 00:00:00 off 1 5 0.4M NMM/HBTU/DMF 1 00:40:00 on 1 6 DMF 1 00:00:30 on 3标准切割程序Step solvent/operation volume mix time drain Rep 1