动物细胞培养.pptx

第1页/共22页细胞培养的相关概念细胞培养：细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。第2页/共22页原代培养：从动物机体取出的进行培养的细胞群。除肿瘤细胞以外，原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。传代培养：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。分离一次再培养称为传一代。细胞系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖。细胞株：从原代培养或细胞系中获得的有特殊性质或标志的细胞。在培养过程中其特征始终保持。 第3页/共22页(一)培养细胞的特性(一)培养细胞的特性1.培养细胞的生长方式贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。是多数体外培养细胞的基本生长特点。见于各种实体瘤细胞。虽然血细胞如淋巴细胞在活体体内并无聚集的倾向并在体外可于悬浮状态中生长，但是大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长。接触抑制及密度依赖性悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。第4页/共22页常用培养容器细胞培养瓶，微孔板，平皿等第5页/共22页贴壁生长细胞传代方法? 1. 吸光培养瓶中的培养液? 2.加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。? 3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。? 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。? 5. 吸取适量细胞悬液，接种于新的培养瓶内。? 6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。? 7. 将后者放入培养箱中培养。第6页/共22页细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段： 1．潜伏期（Latent Phase）： 细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关 2．指数增生期（Logarithmic growth Phase）：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。第7页/共22页在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续 3～5天后，随细胞数量不断增多，最后细胞相互接触汇合成片。如培养的是正常细胞，相互接触能抑制细胞的增殖，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（Piled up）。3．停滞期（Stagnate Phase）：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代。第8页/共22页细胞生长过程第9页/共22页人微血管内皮细胞株（HMEC-1）细胞状态特征：多角形或梭形，边界清晰，大小均匀，胞核为圆形或椭圆形，位于细胞中央，汇合后呈典型的铺路石样排列。第10页/共22页人口腔皮样癌KB细胞株细胞状态与特征简述：贴壁生长细胞，呈不规则形状。第11页/共22页(二) 培养细胞生长的条件1 细胞的营养需要 培养基：提供细胞培养氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子、生长因子等。2 细胞的生存环境 温度：人类细胞一般用37℃ 气相及pH：95%空气加CO2的混合气体。 pH: 7.2-7.4 。CO2为细胞生长所需要，同时又是细胞代谢的产物，并与维持培养基的pH有关。3 渗透压：因细胞的类型及种族而异。4 无污染及无毒：无毒是培养细胞的必须条件。凡与细胞直接或间接接触者，若具细胞毒性，都会导致细胞的死亡。污染问题包括细菌等微生物的污染、不同细胞类型的交叉污染及上述有害物质的污染。第12页/共22页肿瘤细胞的培养肿瘤细胞（tumor cell）在组织培养中占有核心的位置。首先癌细胞是比较容易培养的细胞，当前建立的细胞系中，癌细胞系是最多的。另外，癌症是对人类威胁最大的疾病，肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段，肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。第13页/共22页取材： 人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要。癌性转移淋巴结活胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养