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三、酵母中的基因表达;1.载体： （1）根据载体的复制序列可分为4类：YEp（酵母附加体质粒）、YRp（酵母复制型质粒）、YCp（酵母着丝粒质粒）、Yip（酵母整合质粒）。;（2）酵母克隆载体： ①含有大肠杆菌的复制原点和抗性基因，可在大肠杆菌中克隆增殖 ②也可在酵母中进行复制和表型选择。酵母表型选择为营养缺陷型（合成氨基酸或核苷酸的酶系突变缺失）或抗性筛选。;2.影响目的基因在酵母菌中表达的因素;②分泌信号的效率：分泌信号包括信号肽部分及前导肽部分的编码序列，可帮助表达产物分泌出酵母细胞并在适当部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。;③终止序列的影响：终止序列保证了转录产物在适当部位终止和加上polyA尾巴，这样形成的mRNA才能比较稳定并被高效翻译。;酵母系统表达的优点：;解决内部降解的方法： （1）在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物,通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用 （2）将培养基的pH 值调成酸性(酵母可在pH 3. 0 ～ 8. 0 的范围内生长) ,以抑制中性蛋白酶的活性; （3）利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。; 利用酵母菌表达外源基因的策略;用酵母表达系统(宿主--载体系统);（1）将目的基因克隆入酵母表达载体 （2）用适当的限制性内切酶消化重组质粒,使之线性化 （3）将线性化的重组质粒转化入酵母菌株(如GS115 , KM71) （4）将转化物接种HIS4 缺陷平板进行第一轮筛选 （5）用不同浓度的G418 平板进行第二轮筛选 （6）挑选10～20 个克隆进行小规模诱导培养,鉴定外源基因的表达量 （7）挑选高水平表达菌株进行大规模诱导培养,以制备外源基因的表达蛋白质。;一、酿酒酵母：单细胞真核微生物，被称为真核生物中的“大肠杆菌”， 最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。1981年用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后， 人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白。;（一）酿酒酵母表达系统组成;2、宿主菌—酿酒酵母;（三）酿酒酵母表达系统高效表达的策略;（四）酿酒酵母表达系统的应用及前景;二、甲醇营养型酵母;（3）能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、正确的折叠和修饰,糖基化也更接近高等真核生物甚至人类。 （4）Pichia pastoris 、Pichia methanolical 、Hansenula polymorpha、Candida biodinii 等甲醇酵母已发展成为高效的表达系统, 已成功表达了多种重组蛋白并显示出巨大的优越性，成为目前基因表达优先考虑的表达系统。;①具有强有力的、易控制的AOX启动子,可严格调控外源蛋白的表达; ②可对表达蛋白进行翻译后加工和修饰,即二硫键的形成、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N-糖基化、O-糖基化,从而使表达出的蛋白具有生物活性; ③对营养要求低,生长快, 培养基廉价,便于工业化生产; ④可高密度发酵培养,蛋白产量高; ⑤表达量高,如破伤风毒素C 片段表达量高达12 g/ L; ⑥甲醇酵母自身分泌的背景蛋白少,表达产物较易纯化,表达的蛋白既可存在于胞内,又可分泌至胞外,如表达的重组水蛭素(HIR) 仅经过两步层析纯化,纯度就高达97 %以上; ⑦糖基化程度低,和酿酒酵母相比,甲醇酵母中加到翻译蛋白的糖链每条长度为8～14 个甘露糖残基,较之酿酒酵母(50～150 甘露糖残基) 短得多。此外,酿酒酵母核心多糖末端存在α-1 ,3 糖苷键,使这些蛋白具有高度的抗原性,因而不适宜作治疗制剂,而甲醇酵母没有。;（1）缺乏葡萄糖、甘油时, 利用甲醇为惟一碳源。 （2）甲醇在乙醇氧化酶作用下被氧化成甲醛,在过氧化物酶体中氧化成H2O2。 （3）乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱,因此代偿性地大量产生该酶,调控这种酶的启动子是强启动子,可用来调控异源蛋白的表达。两种乙醇氧化酶(即AOX1 和AOX2) ,细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供。 ;（4）当aox1 基因缺失只存在aox2 时,大部分的乙醇氧化酶活力丧失,细胞利用甲醇能力降低,细胞在甲醇培养基上生长很慢,这种菌株被称为Muts (Methanol utilization slow) ; aox1 基因存在时,细胞利用甲醇能力正常,在甲醇培养基上生长较快,这种菌株表型被称为Mut + 。 （5）aox1 基因的表达为转录水平调控。aox1 基因的调控是一个抑制机制加上诱导机制的过程,在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转录,而在以甲醇为惟一生长碳源时诱导基因转录,蛋白质表达。 （6)甲醇酵母生长适宜温度一般为28～30 ℃。诱导期间如果温度超过32 ℃,不利于蛋白表达,甚至会导致细胞死亡。;2、载体：主要是可以整合到酵母基因组中的整合