荧光定量pcr核酸检测技术.ppt

主要表现为PCR产物分析手段落后： 琼脂糖凝胶电泳法只能判断产物片段大小，并不能鉴别产物特异性。造成传统PCR检测缺点非特异性难以判断、假阳性多和重复性差等。 实验室管理制度落后； 人员培训水平落后； ;反相膜杂交技术 复星 微孔板杂交技术 复星、华美、复华、 浩源、锦宏 荧光PCR技术 复星、达安、匹基;反相膜杂交技术原理;反相膜杂交原理示意图;主要优点：1.操作简便；2.无特殊设备要求； 3.适合于分型；4.结果可原始保存。 主要缺点：只能进行半定量操作;微孔板杂交技术原理;微孔板杂交技术原理示意图;主要优点： 1. 杂交部分操作类似于ELISA，实验人员较熟悉； 2.可向全自动过度； 3.可定量操作。 主要缺点： 1.分型困难； 2.试剂成本较高； 3.操作较复杂。 ;荧光PCR技术原理;荧光PCR技术原理示意图;主要优点： 1.能对靶基因进行定量检测； 2.在封闭状态下进行产物检测，减少了污染机会。 主要缺点： 1.仪器设备昂贵，不利于推广； 2.分型困难。;核酸检测实验室的设置;前PCR区2（标本制备实验室） 用途：该实验室用于分离和抽提病原微生物中的核酸，防止因标本处理而引起的实验室感染和检测的交叉污染。 基本设备：1.实验室应有紫外灯；2. 超净台或PCR防 污染罩；3.冰箱（4℃，-20℃）；4. 高压灭菌器(处理传染性标本和物品)；5.高速和低速离心机、旋涡振荡器、各种规格移液器（0-10ul、40-200ul、50-1000ul）等；6. 高压灭菌的各种Eppendorf管和移液器吸嘴；7. 专用文具用品；8.救护药箱，包括外伤用药，眼睛冲洗液等；9. 实验桌椅（实验台台面防酸、防碱和耐热）；10.电话机（备有关临床医生的电话号码，以便因突发事件及时联系）；11.自来水设备。 ;后PCR区（扩增和分析实验室） 用途:该实验室用进行PCR扩增和PCR扩增产物的各类分析操作。 基本设备：1.实验室应设有紫外灯；2.各类PCR扩增仪； 3.电泳仪、电泳槽、紫外分析仪；4.照相设备或凝胶分析系统；5. 台式小型高速离心机、孵育箱（水浴或恒温）； 6. 冰箱（4℃、-20℃）；7. 微波炉；8. 配套移液器（若干）；9. 高压灭菌的各种Eppendorf管和移液器吸嘴。 10. 电脑和专用文具用品、救护药箱；11. 实验桌椅（实验台台面防酸、防碱和耐热）；12. 自来水设备; 13.其他仪器：根据检测方法不同而定。 ;定量技术比较;;试剂盒的检测灵敏度;荧光定量PCR试剂盒检测HBV-DNA结果与临床的关系;经统计，X2=1.15，P0.05，表明在HBsAg/HBeAg/抗HBc阳性和HBsAg/抗HBe/抗HBc阳性组中病毒载量的差异显著，HBV DNA 和HBeAg密切相关。该定量结果能够反映在这两种血清学模式中病毒DNA的复制情况，对于临床辅助诊断有重要作用。;慢性肝炎患者干扰能治疗过程中病毒核酸的动态变化上海第二医科大学附属瑞金医院传染科（200025）罗振辉 厉惠莉 高健 张东华; 部分讨论： 15例病人中eAg均为阳性，但HBV-DNA值的差异甚大，从1.768Meq/ml 到4800 Meq/ml，该值更确切的反映了机体的感染状态，其高低可能与感染的严重程度及病毒复制的活跃情况呈正相关；与机体免疫清除的时间和强度呈负相关。高值示感染严重或清除无力；反之表示感染较轻或清除强力。 实验表明HBV-DNA低值者疗效较佳； 无论HBV-DNA值是高是低，治疗后HBV-DNA均见一定程度下降，其下降的幅度与病例的选择； eAg的阴转率6个月时为8/15，和国内外诸多报告大致相似，此变化和HBV-DNA值的低下基本吻合，但HBV-DNA值在6个月时已有9例小于0.7 Meq/ml，且见HBV-DNA的变化大多早于eAg的阴转，一般提早2个月，个别提前4个月，可见HBV-DNA值的检测远较观察eAg更敏感、更确切的反映了干扰能抗病毒的作用。;ALT的变化通常也是评估干扰能治疗的重要指标，本组病例6个月时ALT下降至正常者为11/15（73.3%），无明显变化或升高者为4/15，此变化和HBeAg的阴转大致吻合，但和HBV-DNA 低下并非完全一致。2号病例持续用药至8个月时ALT明显升高，继续减量用药后，HBV-DNA低下，有力的说明了ALT升高是机体清除病毒的正常表现，故以ALT复常为评估指标应有辨证的观点。 结论：